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糖基化是真核生物蛋白质合成后的一种修饰方式,在维持蛋白质的功能及稳定性等方面发挥着重要的作用。真菌植酸酶是高度糖基化的糖蛋白,一般有9-11个糖基化位点（N-X-T/S）及活性保守位点序列RHGXRXP和底物结合相关的HD序列。虽然有研究发现,去糖基化会影响植酸酶的热稳定性及催化活性,但不同表达系统表达的植酸酶,糖基化程度不同,却与植酸酶的热稳定性没有直接关系。因此植酸酶的糖基化对酶的催化活性及结构稳定性的作用不十分清楚。本研究利用定点突变的方法,通过改变植酸酶分子中的糖基化位点来研究糖基化对植酸酶的酶学性质的影响,为获得具有工业应用潜力的商品植酸酶提供更广泛的思路。1.利用克隆的黑曲霉Aspergillus niger N-3植酸酶基因为模板,通过定点突变引入糖基化位点（A328T和A328S）、删除糖基化位点（N326S/A328T）或改变相关的氨基酸残基（N326D）,得到4个相应的突变体。对发酵产生的植酸酶进行纯化,SDS-PAGE分析发现,与野生型植酸酶相比,突变植酸酶的表观分子量并没有明显变化,说明糖基化程度相似。用糖苷内切酶去糖基化后,分子量由80 kD左右降低到50 kD。对酶的催化能力测定表明,纯化后的植酸酶单位毫克蛋白的催化活力（比活力）,以突变体A328T的变化较明显,比野生型提高了约14%,突变体N326D略有降低,而其它两个突变体无明显变化。2.对植酸酶最适pH的研究表明,野生型重组植酸酶A. niger N-3的最适pH值有2个峰,分别为pH 2.0和pH 5.5,其中在pH 2.0处的酶活力比pH 5.5高约30%。去糖基化处理后,其最适pH发生改变,虽仍然有2个峰值,但在pH 3.5处表现出最高酶活力,说明糖基化直接影响植酸酶的最适pH值。与野生型植酸酶相比,4种突变植酸酶均在pH 2.5和pH 5.5处出现两个峰,但pH 5.5处的酶活力明显提高,两个pH之间酶活力相差不足5%,说明HD序列附近氨基酸残基的改变会影响植酸酶的最适pH。3.酶促反应动力学研究发现,突变植酸酶A328T与底物的亲和力提高,其Km与野生型相比降低了大约26%,kcat与kcat/Km大幅提高,表明在此处将苏氨酸替换为丙氨酸,大大提高了酶对底物的专一性,同时也提高了酶的催化效率,可能是引入糖基化位点后,影响了其前后紧邻的两个糖基化位点的糖基化,使得酶与底物结合的更加紧密。4.热稳定性分析表明,突变植酸酶A328T的热稳定性比野生型有显著提高,85℃下15 min的剩余活力比野生型提高30%左右,而突变酶A328T的热稳定性与野生型差别不大。两种突变酶都是额外引入糖基化位点,前人研究发现N-A-T结构（A328T）比N-A-S结构（A328S）更容易糖基化,这也许是两突变酶热稳定性差别的原因。突变酶N326D和N326S/A328T的热稳定性比野生型稍有降低,与所报道的326 N可能对植酸酶的稳定性有贡献相符。5.对植酸酶空间结构研究表明,将植酸酶置于在85℃条件下处理1h,突变酶A328T几乎没有发生红移,而突变酶N326D红移了接近4 nm。这说明在高温条件下,突变酶A328T仍能保持完整的空间结构,而突变酶N326D的局部空间结构则发生了微弱的变化,使其荧光发射基团更加暴露。因此,突变酶A328T具有更好耐热性及催化活力。