那拉提土壤拮抗放线菌鉴定及次生代谢产物初探

来源 :塔里木大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:zhangstian
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本文对新疆那拉提草原土壤进行了活性放线菌富集预处理,并对活性放线菌分离纯化及16S rDNA鉴定,对分离到的放线菌进行抑菌活性和化学指纹双重筛选,建立了“生存胁迫”法和“一室一菌”96孔板法相结合的快速高效分离活性强、次生代谢产物丰富的土壤活性放线菌方法。将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis ATCC 35984)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)、白色念珠菌(Candida albicans ATCC 64550)、棉花黄萎病(Verticillium dahliae ACCC 36211)、棉花枯萎病(Fusarium oxysporum f sp.Vasinfectum ACCC31038)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici ACCC36278)病原菌混合接种于那拉提土壤中,预处理20 d后,采用96孔板法分离土壤放线菌,纯培养经16S rDNA鉴定,共分离获得30株放线菌。对30株放线菌进行发酵,发酵产物采用“滤纸片法”进行活性筛选,指示菌为白色念珠菌(C.albicans ATCC 64550)、大肠杆菌(E.coli ATCC 25922)及金黄色葡萄球菌(S.aureus ATCC 6538),同时采用HPLC法分析发酵产物中次生代谢产物的丰富程度,结果显示30株放线菌中27株至少对一种指示菌具有活性,拮抗活性放线菌比例高达90%,30株放线菌全部有不同程度的次生代谢产物产生。以ISP3液体培养基对链霉菌TRM70003进行发酵,发酵产物经大孔吸附树脂、硅胶柱层析、凝胶柱层析、制备液相等方法分离纯化,最终得到3个单体化合物,经1H NMR、13C NMR、HSQC、HMBC等谱图数据解析,对比已有文献报道,确定3个化合物为:星形孢菌素、2-甲基-放线菌素D和放线菌素D。对灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens TRM11107)全基因组测序、抗生素合成基因簇预测及抗生素的分离鉴定,实现了基因组视角下抗生素的定向分离。采用Illumina技术对链霉菌TRM11107全基因组测序,及抗生素合成基因簇在线软件antiSMASH在线分析预测TRM11107中的抗生素合成基因簇,发现其中有8个相似度在75%抗生素合成基因簇,其中包括拒霉素合成基因簇,对TRM11107发酵及产物的分离鉴定,结果成功分离鉴定了两个抗生素:拒霉素和特曲霉素,从而实现了基因组视角下特定抗生素的定向分离。通过向发酵培养基中添加复合维生素,提高链霉菌TRM11107中拒霉素的产量,结果,向ISP3液体培养基中添加64.3mg/L复合维生素可将拒霉素产量提高到806.79 mg/L,是起始产量的21.5倍。
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