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植物在受到某些外界物理、化学或者生物等因素侵袭时会产生一种系统获得性抗性(SAR),使植物能够抵抗病原微生物的侵染。Y3蛋白是从食用菌毛头鬼伞(Coprinus comatus Muell.ex Fr.)中提取的一种碱性糖蛋白,对心叶烟枯斑寄主上的烟草花叶病毒(TMV)的侵染抑制率高达83.0%,可以较强的抑制烟草花叶病毒的复制。据前期试验表明Y3蛋白可以与TMV外壳蛋白(CP)结合互作,从而降低病毒的侵染率。同时,我们也推测对烟草花叶病毒如此高的抑制作用,可能不仅是通过这种途径抑制烟草花叶病毒,有可能类似于紫茉莉抗病毒蛋白(MAP)一样,可以诱导烟草本身产生系统抗性,从而抵抗TMV的侵染。 本文以毕赤酵母真核表达系统为研究系统,克隆获得了Y3蛋白基因并与真核表达载体连接,成功实现了Y3蛋白的真核表达。并以烟草和TMV为研究对象,研究真核表达的Y3蛋白对烟草花叶病毒(TMV)的系统诱导抗性,测定了一些烟草抗病防御酶的活性;利用实时荧光定量PCR技术研究了Y3蛋白系统诱导抗病性的信号传导途径,其结果如下: 1.通过将Y3蛋白基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC-9k中,构建了Y3蛋白真核表达载体,电击转化至毕赤酵母GS115,Y3蛋白得到表达,经试验验证得出1.0%的甲醇诱导获得的Y3蛋白表达量最高。 2.将真核表达的Y3蛋白分别喷施感病前后的烟草和健康烟草,除过氧化物酶(Peroxidase,POD)外,多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylanlanine ammonialyase,PAL)、几丁质酶(Chitinase)和β-1,3葡聚糖酶(β-1,3 glucanase)等抗病防御酶的活性相对对照组均有不同程度的增强。初步证明Y3蛋白可能诱导产生系统抗病性。 3.实时荧光定量 PCR 技术检测发现,Y3蛋白喷洒烟草叶片后,系统获得抗病性标志基因酸性病程相关基因1(Acid pathogenesis-related gene 1,PR1-a)和碱性病程相关基因1(Basic pathogenesis-related gene 1,PR1-b)上调,水杨酸信号传导途径关键基因病程相关基因非表达子1(Nonexpressor of pathogenesis-related gene 1,NPR1)上调,水杨酸合成关键酶基因苯丙氨酸解氨酶基因(Phenylalanine ammonia lyase gene,PAL)上调。进一步证明Y3蛋白是通过启动烟草的水杨酸信号传导途径诱导烟草产生系统获得性抗性,使烟草产生了抗病防卫反应。 该研究丰富了蛋白诱导剂与植物互作理论,为进一步揭示蛋白类诱导剂植物系统获得性抗性及机制的研究奠定了基础。