研究背景：由凝血因子ⅩⅢ（coagulation factorⅩⅢFⅩⅢ）抑制物引起的FⅩⅢ缺乏是一种十分少见的出血性疾病，目前国际上有正式文献报道的病例仅34例。该病发病年龄较大，无男女性别差异。FⅩⅢ抑制物通过中和FⅩⅢ的活性，导致纤维蛋白单体间交联异常，使患者血浆纤维蛋白凝块不稳定，从而出现严重的反复自发性出血，出血部位广泛，常表现为皮肤粘膜瘀斑、软组织及肌肉血肿、内脏出血、术后延迟性出血甚至颅内出血等，该病出血症状重，治疗困难，死亡率接近50％。FⅩⅢ抑制物产生原因不明，已有的研究结果提示可能与自体免疫紊乱有关。一些自身免疫性疾病（如系统红斑狼疮）或长期应用某种药物（如异烟肼、青霉素等）可导致产生FⅩⅢ抑制物，1％的遗传性FⅩⅢ患者在接受FⅩⅢ浓缩物替代治疗后可产生FⅩⅢ抑制物。亦有部分FⅩⅢ抑制物在正常人体内自发产生。目前报道的FⅩⅢ抑制物绝大部分为多克隆或单克隆IgG，以IgG1优势表达为主，可作用于纤维蛋白多聚体形成过程中的各个环节。根据FⅩⅢ抑制物作用位点不同可将其分为三种类型，Ⅰ型FⅩⅢ抑制物直接抑制FⅩⅢ的活化，Ⅱ型FⅩⅢ抑制物影响FⅩⅢa（activated factorⅩⅢFⅩⅢa）的转氨酶活性，Ⅲ型FⅩⅢ抑制物阻断FⅩⅢa与纤维蛋白底物反应。FⅩⅢA亚单位为功能亚单位，分为激活肽（含有凝血酶结合位点）、β夹心区、核心区(含有Ca²⁺结合位点和转氨酶活性位点)、折叠桶状区1、折叠桶状区2等五个结构域，有关FⅩⅢ抑制物作用于FⅩⅢA亚单位的具体结构表位尚不清楚。我们最近3年诊断了国际上首例继发于意义未明的单克隆丙种球蛋白血症的FⅩⅢ抑制物和国际上第3例继发于系统性红斑狼疮的FⅩⅢ抑制物，分别对其临床特点、免疫学特性及发病机理进行了深入研究。第一部分凝血因子ⅩⅢ抑制物致获得性凝血因子ⅩⅢ缺乏的临床特点、诊断和治疗目的：分析FⅩⅢ抑制物致获得性FⅩⅢ缺乏患者的临床及实验室特点，确定诊断，以加深对获得性FⅩⅢ抑制物引起出血的临床特点和实验室发现的认识，提高对该病的诊断水平及治疗缓解率。方法：①对2例患者的临床出血表现、出血部位、出血史、家族史及原发病病史进行详细采集与分析；②进行活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（FIB）、D-二聚体（D-D）、血小板聚集功能等实验室检查；用尿素溶解试验及其纠正试验证实FⅩⅢ抑制物的存在；利用western blot结合蛋白条带灰度扫描确定患者体内FⅩⅢ含量；③用免疫抑制剂及新鲜冷冻血浆输注，观察患者临床症状的改善情况，以判断临床治疗效果。结果：①两位患者的临床表现均符合FⅩⅢ缺乏的临床特点，病例1患者此次起病前曾患意义未明的单克隆球蛋白血症，病例2患者起病前曾患系统性红斑狼疮，此后均出现不明原因的多部位出血。既往无出血史及出血家族史，故出血性疾病显然为获得性因素所致。②凝血机制实验室检查结果：两位患者PT、APTT、TT、FIB、D-D、血小板计数和聚集功能均正常；尿素溶解试验结果示两位患者血浆凝块置入5M尿素溶液内后均在24小时内出现溶解（正常对照在48小时后仍未溶解），加入正常血浆均不能纠正；western印迹结合灰度扫描分析显示病例1患者血浆FⅩⅢ浓度为2.9mg／L，病例2患者血浆FⅩⅢ浓度低至检测不到的水平（正常对照为31mg／L）。③用皮质激素结合环磷酰胺及输注新鲜冷冻血浆治疗后，两位患者出血症状明显缓解，病例2患者出院后口服强的松加环磷酰胺，至今未再出现出血症状。结论：①分别诊断了意义未明的单克隆丙种球蛋白血症并获得性FⅩⅢ抑制物及系统性红斑狼疮并FⅩⅢ抑制物两例患者；尿素溶解试验可作为此出血性疾病的初筛试验，进一步的尿素溶解纠正试验、FⅩⅢ定量测定可确定获得性FⅩⅢ抑制物的诊断；②免疫抑制剂及输注新鲜冷冻血浆对控制FⅩⅢ抑制物致获得性FⅩⅢ缺乏患者出血症状有效。第二部分获得性凝血因子ⅩⅢ抑制物对正常血浆凝血因子ⅩⅢ活性及纤维蛋白交联的抑制作用目的：纯化患者及正常人血浆IgG；证明患者体内FⅩⅢ抑制物对正常人血浆FⅩⅢ活性的影响程度及对纤维蛋白交联的抑制作用；从纤维蛋白结构的微观角度探讨FⅩⅢ抑制物对纤维蛋白凝块结构强度的影响。方法：①用蛋白A—琼脂糖柱分离纯化患者及正常人血浆IgG；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及非变性凝胶电泳（native-PAGE）鉴定IgG分子量大小和回收纯化的血浆IgG组分；②分别将纯化的两位患者IgG、轻链及正常人IgG以不同浓度（0 mg／ml、1.38 mg／ml、2.76mg/ml）加入正常人混合血浆中，进行尿素溶解试验以分析其对正常人血浆FⅩⅢ活性的抑制作用；③SDS-PAGE分析两位患者及正常人血浆纤维蛋白凝块中纤维蛋白原各单体的交联；同时分别将纯化的两位患者IgG加入正常人混合血浆中（终浓度为2.76mg／ml），SDS-PAGE分析患者IgG对正常血浆纤维蛋白交联的抑制作用；④应用扫描电镜分析患者及正常人血浆纤维蛋白凝块微观结构上的差异。结果：①分别获得了纯化的患者及正常人IgG和病例1患者血浆轻链蛋白；②加入病例1患者或病例2患者纯化的IgG后，可使正常混合血浆纤维蛋白凝块在5M尿素溶液中24小时内出现部分溶解，且溶解程度呈IgG浓度依赖性；而加入正常人纯化的IgG或回收纯化的病例1患者血浆轻链对血浆纤维蛋白凝块的尿素溶解无影响；③病例1患者血浆纤维蛋白凝块中纤维蛋白单体部分交联成a_n多聚体和γ-γ二聚体，有部分γ单体存在，病例2患者血浆纤维蛋白凝块中纤维蛋白单体则完全无交联；病例1患者IgG可部分抑制正常血浆中a、γ纤维蛋白单体的交联，病例2患者IgG可完全抑制正常血浆中a、γ纤维蛋白单体的交联，而正常人IgG对血浆纤维蛋白的交联无影响；④电镜下可见正常人血浆纤维蛋白凝块由结构致密的纤维蛋白丝组成，纤维蛋白丝较粗，无“网孔”形成；而病例2患者血浆纤维蛋白凝块结构松散，纤维蛋白丝较细，凝块表面有较大的“网孔”形成；病例1患者血浆纤维蛋白凝块结构介于正常人和病例2之间。结论：两位患者血浆IgG在体外可明显中和FⅩⅢ活性，抑制纤维蛋白单体a、γ链的交联，患者纤维蛋白凝块微观结构疏松、纤维蛋白丝较细，形成大小不等的“网孔”样外观，与正常纤维蛋白凝块存在明显差异，说明抑制物引起的FⅩⅢ缺乏或活性丧失，FⅩⅢ对纤维蛋白的稳定效应明显削弱，导致临床上的出血症状。第三部分获得性凝血因子ⅩⅢ抑制物IgG亚型分析及作用于凝血因子ⅩⅢ的表位研究目的：鉴定FⅩⅢ抑制物的IgG亚型；确定患者FⅩⅢ抑制物作用于FⅩⅢ的结构性表位，揭示该病发病的分子机制。方法：①FⅩⅢ／FⅩⅢ抑制物固相结合试验结合Western印迹技术，鉴定FⅩⅢ抑制物的免疫亚型；②SDS-PAGE分析患者IgG对凝血酶活化FⅩⅢ的抑制作用；③人工合成FⅩⅢA亚单位功能结构域的多肽，采用dot印迹分析患者IgG对FⅩⅢ功能结构域作用与否。结果①FⅩⅢ／FⅩⅢ抑制物固相结合后行western印迹结果显示，当以病例2患者血浆孵育PVDF膜过夜后，鼠抗人IgG₁、IgG₄抗体检测在FⅩⅢA亚单位处存在阳性信号，鼠抗人IgG₂、IgG₃抗体检测无信号；以病例1患者血浆孵育PVDF膜过夜后，鼠抗人IgG₁抗体检测在A亚单位处存在阳性信号，鼠抗人IgG₂、IgG₃、IgG₄抗体检测无信号；②用在凝血酶作用于纯化的人FⅩⅢ蛋白，SDS-PAGE分析结果显示，FⅩⅢ由原来分子量不同的A亚单位和B亚单位（两条带）变为分子量相近的A′亚单位和B亚单位（一条带），加入病例2患者IgG后，蛋白条带为A′亚单位和B亚单位，而加入病例1患者IgG共孵育后，蛋白条带仍为A亚单位和B亚单位；③合成了FⅩⅢA亚单位含有钙离子(Ca²⁺)结合位点的多肽片断NH2-YKFQEGQEEE-CONH2(下称多肽_Ca2+)和含有转氨酶活性位点的多肽片断NH2-GWQAVDSTPQ-CONH2(下称多肽_active)，将其分别进行FⅩⅢ／FⅩⅢ抑制物固相结合及dot印迹分析，以兔抗人IgG二抗进行检测，结果显示以病例2患者血浆孵育过夜的PVDF膜在FⅩⅢ、多肽_Ca2+和多肽_active点样处均存在阳性信号，而以病例1患者血浆孵育过夜的PVDF膜在FⅩⅢ点样处存在阳性信号，在多肽_Ca2+和多肽_active点样处不存在阳性信号；而以正常人血浆孵育过夜的PVDF膜在FⅩⅢ、多肽_Ca2+和多肽_active点样处均不显示蛋白信号。结论：①意义未明的单克隆丙种球蛋白血症并获得性FⅩⅢ抑制物IgG亚型为IgG₁，系统性红斑狼疮并FⅩⅢ抑制物IgG亚型为IgG₁和IgG₄；②病例1患者IgG作用于FⅩⅢ凝血酶裂解位点，从而抑制了凝血酶对FⅩⅢ的活化，导致FⅩⅢ的纤维蛋白稳定活性降低；病例2患者IgG作用于FⅩⅢ转氨酶活性位点和Ca²⁺结合位点，抑制了FⅩⅢ的转氨酶活性和Ca²⁺催化的纤维蛋白交联反应，从而说明了FⅩⅢ抑制物作用于FⅩⅢA亚单位的确切功能结构域，揭示了FⅩⅢ抑制物致获得性FⅩⅢ缺乏发病的分子机制。