研究目的：何首乌为临床常用中药,近年来有关何首乌及其制剂临床不良反应报道逐渐增多,尤其是何首乌导致的肝损伤问题。但目前关于何首乌导致肝损伤的成分不明确、报道的研究中也存在诸多矛盾、何首乌以及何首乌不同部位导致肝损伤机制的研究不全面。本研究采用相关性分析等手段对何首乌中致肝损伤成分进行推测并验证、采用iTRAQ定量蛋白质组学以及Non-targeted代谢组学等方法研究何首乌不同提取部位所致肝损伤的作用机制,以期为何首乌的合理应用提供参考。研究方法：1)研究采用UHPLC-Q-TOF/MS分别对生首乌水提物、生首乌醇提物、制首乌水提物以及制首乌醇提物中的化学成分进行分析,所得数据文件以Progenesis QI和Makerlynx XS软件进行处理,采用PCA及OPLS-DA找出差异成分；采用L-02细胞实验对何首乌的肝毒性进行评价。结合毒性差异与成分差异进行相关性分析,找出四种提取物中成分含量与其毒性变化规律一致的成分,并进行验证。2)研究采用二氯甲烷萃取、HPD-300型大孔树脂分离等方法将何首乌中的成分分为5个部分,即水溶性部分(鞣质及多糖为主)、30醇部分(多羟基芪类为主)、70醇部分(结合蒽醌为主)、二氯甲烷部分(游离蒽醌为主),还有未分离的总提取物部分。首先采用体外实验(CCK-8及高内涵筛选)评价这5种提取物的肝毒性；采用SD大鼠连续灌胃给药90天,末次给药后分离血清、血浆(用于Non-targeted代谢组学)以及肝脏(部分肝脏用于iTRAQ定量蛋白质组学)。血清用于测定不同给药组大鼠的肝功能生化指标(ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP、GGT等生化指标),肝脏用于病理分析以及SOD、MDA和GSH-Px等抗氧化指标的测定。3)建立大鼠血浆中主要成分的LC-MS/MS方法,测定大鼠单次灌胃给药给后主要成分的血药浓度,以及计算相关药代动力学参数,结合蛋白质组学结果分析何首乌主要成分、组份之间的相互影响。研究结果：1)L-02细胞毒性表明四种提取物的毒性顺序为：生首乌醇提物>生首乌水提物>制首乌醇提物>制首乌水提物。经相关性分析共找出10个化合物可能与毒性相关,其中有7个化合物为蒽醌或蒽醌苷类化合物,此7个化合物中又有5个是大黄素及大黄素的衍生物,结果表明何首乌的肝毒性与蒽醌类化合物关联性强。2)体外实验细胞数目以及CCK-8的结果显示,总提取物及30醇部分具有较强的细胞增殖抑制作用；水溶性部分、70醇部分以及二氯甲烷部分在相同的生药量下虽然显示出较弱的细胞毒性,但5种提取物的GSH水平检测结果均为阳性,说明此5种提取物对肝细胞均能产生毒性,原因可能与细胞清除自由基能力减弱有关；总提取物、水溶性部分以及二氯甲烷部分的MMP检测结果均为阳性,说明此三种提取物产生细胞毒性与MMP的改变有关。体内肝组织病理形态学检查显示给予何首乌不同部分后,肝细胞可出现不同程度的水肿、脂肪变性以及部分点状坏死、气球样变性、空泡样变性,并有部分动物出现中央静脉炎症细胞灶性浸润、肝组织局灶性坏死等现象,说明5种何首乌提取物均能导致肝损伤；SOD等抗氧化指标的测定结果表明,肝损伤机制可能与氧化损伤相关；血清生化指标表明水溶性部分组、30醇部分组、70醇部分组以及二氯甲烷组大鼠血清中的AST、ALT、ALP、LDH值相比空白对照组明显升高,尤以30醇部分组升高最为明显；总提取物组AST、ALT、ALP及LDH未见明显升高,TBIL、DBIL、GGT相比空白对照组明显升高,说明此组大鼠发生的肝损伤机制可能存在差异,这种差异可能与提取物中成分的种类以及含量的差异相关。3) iTRAQ定量蛋白质组学技术对口服何首乌不同部位所致肝损伤大鼠与正常大鼠肝脏蛋白质表达谱进行比较分析,共鉴定出iTRAQ标记定量信息的肽段共23619个、蛋白共2040个。Pathway分析结果表明,氧化磷酸化途径、帕金森病途径、亨廷顿病途径、阿尔茨海默症途径及剪接体途径为5组共有的,同时筛选出31个共表达蛋白。代谢组学研究采用PCA、OPLS-DA分析,利用VIP以及S-plot选出其中具有较大相关性的变量。5组差异代谢物经鉴定后进行Metabolic Pathway分析,共找出甘油磷脂代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、亚油酸及α-亚麻酸代谢、花生四烯酸代谢、苯丙氨酸代谢等15条代谢通路,与其相关的潜在生物标志物22个。包括甘油磷脂类,如溶血磷脂酰胆碱(LysoPC(15:0)、LysoPC(16:0)、LysoPC(17:0)、LysoPC(18:0)、LysoPC(P-18:1)等),磷脂酰胆碱PC(16：0/16：0)；不饱和脂肪酸类,如花生四烯酸、DHA等；类固醇及胆汁酸类,如硫酸胆固醇、牛黄去氧胆酸、鹅去氧胆酸硫酸盐；除此之外还有甲羟戊酸、苯乙胺、棕榈酸等化合物。4)采用LC-MS/MS同时测定SD大鼠血浆中的二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷以及大黄素的含量。其中水溶性部分在大鼠血液中未测出；总提物组以及30醇部分组二苯乙烯苷含量接近,但30醇部分的Cmax、AUC高于总提物组；MRT、t1/2低于总提物组；总提取物组、30醇部分、70醇部分以及二氯甲烷部分大黄素的给药剂量分别为4.91、0.11、0.23、3.67mg/Kg,70醇部分Cmax要高于总提取物以及二氯甲烷部分,二氯甲烷部分Cmax、AUC等参数明显低于总提取物组。研究结论：何首乌中致肝损伤的成分可能与蒽醌类化合物(尤其是大黄素及其衍生物)有关,但由于部分成分目前没有获得单体化合物,所以其验证工作还需进一步研究。蛋白质组学以及代谢组学研究结果表明,何首乌导致肝损伤主要是与线粒体功能的氧化磷酸化、TCA循环信号通路传导异常相关。当NADH脱氢酶家族表达异常、苯丙氨酸代谢异常时,会导致氧化磷酸化功能障碍、线粒体功能受损,同时呼吸链中的电子泄漏增多,进而使ROS产生增加；以及释放Cyt c, caspase-9被Cyt c激活后可继续激活caspase-3而导致细胞凋亡。甲状腺激素信号通路也与caspase-3、caspase-9的表达有关,转运蛋白Slc16a2低表达致使PI3K/Akt信号通路以及Akt不能顺利激活,进而导致p53蛋白以及Caspase-9的表达不能被抑制而导致细胞凋亡。甘油磷脂代谢异常是5组肝损伤大鼠共有情况。甘油磷脂代谢通路异常产生的溶血磷脂酰胆碱如LPC(18：2)、LPC(22:0)、LPC(22:6)可以作为何首乌致肝损伤的标志物。FABP的低表达可以使PPAR-α、β/δ、γ异位表达,PPAR-a通过调控靶基因的表达而调节机体许多生理功能包括包括脂肪酸摄取、结合、氧化及脂质运输、生长发育等,在脂质代谢中起着关键的调节作用；溶血磷脂酰胆碱在血液中浓度增高,可使红细胞膜溶解,导致溶血性疾病,总提取物组的血浆胆红素水平升高可能也与此有关,但具体原因还有待进一步研究。除以上机制外,花生四烯酸代谢通路,与胆汁酸及类固醇类化合物生成、代谢相关的类固醇合成途径、类固醇激素生物合成途径等都与何首乌致肝损伤相关。药代动力学研究结果表明,30醇部分大鼠血浆中二苯乙烯苷的Cmax、AUC高于总提物组,MRT、t1/2低于总提物组,30醇部分以及70醇部分组大鼠血浆中大黄素的MRT低于总提物,差异可能与总提物组代谢酶的表达有关,同时研究发现大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷给药后在体内迅速脱糖生成大黄素,导致大黄素的Cmax、AUC升高。由此可见,提取物成分不同可能会导致代谢酶的表达差异以及成分的体内行为不同,可能会进一步导致肝损伤。