研究背景与意义胃癌（gastric cancer,GC）是引起全球癌症相关死亡的主要原因之一,在中国,根据中国肿瘤登记年报统计显示,2017年胃癌在男性癌症死亡中位于第三位,而在女性中居于第二位。随着诊断和治疗技术的迅速发展,胃癌的发病率和死亡率逐渐降低,但胃癌一般发现较晚,诊断时多数处于中晚期,恶性程度高,预后差,严重降低患者的5年生存率（发生转移的患者5年生存率甚至低于7%）^[1]。因此,找出在胃癌发生发展进程中具有重要作用的癌基因,明确其涉及的调控机制,对寻找胃癌新的治疗靶点具有重要作用。KIAA1199是HUGE（人类未知基因编码大型蛋白数据库）蛋白质数据库中KIAA基因家族的重要成员,早期报道,与非综合性耳聋有关。然而,近几十年来,随着对KIAA1199的深入研究,大量的研究表明,KIAA1199可以影响癌细胞的增殖、粘附、运动、侵袭和表皮间质化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）等过程,调控着多种癌症的进展、转移和不良预后。在胃癌中,有研究发现KIAA1199在胃癌组织中高表达,临床上,与胃癌患者的预后、淋巴结转移有关,但KIAA1199在胃癌中表达升高及调控胃癌细胞增殖、转移的具体分子机制却鲜有报道。因此,深入探究KIAA1199在胃癌生长、转移中的作用及其在胃癌中上调的原因,对进一步了解胃癌的发生发展具有重要意义,可以为胃癌的治疗提供新的思路。研究目的1.明确KIAA1199在胃癌中的表达及临床意义。2.探究KIAA1199促进胃癌细胞增殖的作用及机制。3.明确KIAA1199在体内外诱导胃癌转移的作用及机制。4.阐明KIAA1199在胃癌中表达上调的分子机制。研究方法1.胃癌组织及细胞中KIAA1199的表达及临床意义采用高通量芯片法,检测4对胃癌患者原发肿瘤组织和匹配的非肿瘤组织的mRNA表达谱,筛选差异表达的mRNA（筛选标准:倍数改变≥1.5,P<0.05）。采用免疫组化技术和qRT-PCR法检测60对配对胃癌及癌旁组织中及细胞中KIAA1199的表达。并采用Image-Pro Plus 6.0评分系统对免疫组化结果进行评分。通过临床随访信息及oncomine大数据分析KIAA1199与临床指标的相关性。采用Kaplan-Meier曲线评价KIAA1199表达水平与胃癌患者预后的相关性。2.体内外研究KIAA1199诱导胃癌细胞增殖的作用及机制利用KIAA1199 siRNA干扰KIAA1199的表达;利用慢病毒系统,将完整的KIAA1199序列通过pcDNA3.1,psPAX2,pMD2.G,pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen-T2A-Puro质粒转入慢病毒载体中,构建HBLV-GFP-Puro-KIAA1199慢病毒载体,并感染胃癌细胞系SGC-7901细胞,获得稳定过表达KIAA1199的SGC-7901稳转株。采用qRT-PCR、IFC和WB技术检测KIAA1199抑制或过表达的有效性。并在体外,通过CCK8实验,检测干扰或过表达KIAA1199后胃癌细胞AGS和BGC-823增殖能力的变化;在体内,采用裸鼠移植瘤模型研究过表达KIAA1199对胃癌生长的影响。为明确KIAA1199诱导胃癌细胞增殖的机制,采用流式细胞术检测在胃癌细胞系中干扰KIAA1199后细胞凋亡和细胞周期的变化。3.体内外研究KIAA1199诱导胃癌转移的作用及机制在体外,采用Transwell实验检测干扰或过表达KIAA1199后对胃癌细胞迁移能力的影响;在体内,采用腹腔播散模型和肺远端转移模型探究KIAA1199对胃癌转移的影响。在腹腔播散模型中,通过腹腔给裸鼠注射1×10⁶个稳定过表达KIAA1199的SGC-7901细胞及对照胃癌细胞,4周后颈椎脱臼处死小鼠,打开腹腔,找到转移灶,计数、统计并拍照;在肺远端转移模型中,通过尾静脉给裸鼠注射2×10⁶个稳定过表达KIAA1199的SGC-7901细胞及对照胃癌细胞,8周后颈椎脱臼处死小鼠,取出肺部,并用4%多聚甲醛固定石蜡包埋,通过HE染色找出肺转移灶,计数、统计并拍照。为明确KIAA1199诱导胃癌细胞转移的机制,采用qRT-PCR和WB实验检测干扰或过表达KIAA1199后对EMT标志物（N-cadherin和E-cadherin）mRNA和蛋白水平的影响。采用免疫沉淀法和质谱分析方法研究与KIAA1199相互作用的蛋白因子,并结合oncomine大数据库分析在胃癌中与KIAA1199相关的信号通路分子。然后抑制或过表达KIAA1199,通过WB实验及免疫荧光技术分析对下游信号通路蛋白表达的影响。此外,为了进一步明确WBP11和PTP4A3是否是KIAA1199的下游效应分子,我们将KIAA1199过表达细胞中的WBP11和PTP4A3敲除,然后通过CCK8实验、Transwell实验以及Western blot实验,检测对胃癌细胞增殖、迁移和EMT标志物及KIAA1199下游信号通路关键蛋白水平的影响。4.KIAA1199在胃癌中表达上调的分子机制的研究首先,结合TCGA数据和TargetScan数据,确定哪些靶向KIAA1199并同时在胃癌中下调的miRNA。然后采用Pearson相关性分析和线性回归分析分析哪些miRNA与KIAA1199呈显著负相关。最后通过双荧光素酶报告基因检测、qRT-PCR和WB实验证明KIAA1199是miR-29c-3p的靶基因,miR-29c-3p可以调控KIAA1199的表达。此外,为了更深入探究miR-29c-3p对KIAA1199的调控作用,在体外,通过qRT-PCR定量检测、Transwell实验和WB实验,我们研究了miR-29c-3p在胃癌细胞转移中的作用以及miR-29c-3p与KIAA1199及KIAA1199下游信号通路蛋白的关系;在体内,运用裸鼠移植瘤模型、腹腔播散模型和远端肺转移模型研究了miR-29c-3p过表达在胃癌生长及转移中的作用,并使用t检验来确定组间的差异,HE染色用于确定肺转移灶,同时采用IHC和qRT-PCR检测转移灶中KIAA1199的表达。研究结果1.胃癌组织及细胞中KIAA1199的表达及临床意义1.1胃癌组织及细胞中KIAA1199的表达首先,经mRNA高通量芯片筛选,发现KIAA1199是胃癌中显著上调的基因之一,与TCGA大数据库中显示KIAA1199在胃癌中显著高表达结果一致。接下来,进一步在60对配对的胃癌及癌旁组织中,通过qRT-PCR（P<0.001）和免疫组化实验（P<0.05）检测KIAA1199的表达,得到了相同结论:KIAA1199在胃癌组织中表达显著上调。此外,我们还检测了KIAA1199在胃癌细胞系（AGS,BGC-823,HGC-27,SGC-7901）和正常胃黏膜上皮细胞（GES-1）中的表达,发现KIAA1199在胃癌细胞系（AGS,BGC-823,SGC-7901）中的表达水平高于正常胃黏膜上皮细胞（P<0.001）。1.2 KIAA1199与临床指标的相关性通过统计临床随访信息,临床相关性分析显示,KIAA1199表达与胃癌TNM分期显著相关,III/IV期胃癌患者组KIAA1199表达显著高于I/II期胃癌组（P<0.05）。此外,与未转移的原发性肿瘤相比,发生转移组患者KIAA1199表达明显升高（P<0.05）。通过对Oncomine大数据（https://www.oncomine.org/）的分析,我们发现KIAA1199高表达与胃癌术后淋巴转移及术后胃癌复发相关（P<0.05）;而且Kaplan-Meier Plotter（http://kmplot.com/,排除GSE62254数据集）分析显示KIAA1199高表达与胃癌患者生存不良相关。以上结果表明,KIAA1199在胃癌中上调,其上调与胃癌的进展、淋巴结转移、术后复发和生存预后显著相关。2.体内外研究KIAA1199诱导胃癌细胞增殖的作用及机制2.1 KIAA1199的在胃癌生长中的作用在体外,CCK8细胞增殖实验结果显示,KIAA1199的下调显著抑制AGS（P<0.01）和BGC-823（P<0.001）细胞增殖,而KIAA1199过表达显著促进SCG-7901细胞增殖（P<0.001）。在体内,通过建立裸鼠移植瘤模型,在裸鼠背部左右两次分别皮下注射能稳定过表达KIAA1199的胃癌细胞系（SGC-7901细胞）及对照SGC-7901细胞,发现过表达KIAA1199组肿瘤体积显著大于对照组（P<0.05）。2.2 KIAA1199调节胃癌细胞增殖的机制流式细胞术实验结果显示,KIAA1199基因敲除后细胞凋亡增加,并且KIAA1199基因敲除可在一定程度上诱导AGS（P<0.05）和BGC-823（P<0.001）细胞周期阻滞。上述结果提示,KIAA1199可以通过调节细胞的凋亡来调控胃癌细胞的增殖。3.体内外研究KIAA1199诱导胃癌转移的作用及机制3.1 KIAA1199的在胃癌转移中的作用体外Transwell实验结果显示,干扰KIAA1199的表达显著抑制了AGS（P<0.05）和BGC-823（P<0.01）细胞的迁移。然而,当KIAA1199过表达时却显著促进了胃癌细胞的迁移（P<0.05）。体内腹腔播散转移模型结果显示,与注射对照SGC-7901细胞组的小鼠相比,注射稳定过表达KIAA1199的SGC-7901细胞组的小鼠腹腔内肉眼可见的结节明显增多（P<0.001）。同时,我们在稳定过表达KIAA1199的SGC-7901细胞组的小鼠肝脏中发现了转移灶的形成。在肺远端转移模型中,与注射对照SGC-7901细胞组的小鼠相比,注射稳定过表达KIAA1199的SGC-7901细胞组的小鼠肺部转移灶显著增多（P<0.01）。3.2 KIAA1199调控胃癌细胞转移的机制从机制上讲,由于细胞迁移增加可能是表皮细胞发生间质化（EMT）引起,于是我们检测了KIAA1199表达上调或下调对EMT一些分子标志物的影响。qRT-PCR结果显示KIAA1199下调能显著降低间质细胞标志物N-cadherin的表达（P<0.05）,增加上皮细胞标志物E-cadherin的表达（P<0.05）。相反,当KIAA1199表达上调时能显著降低E-cadherin的表达（P<0.001）,增加N-cadherin的表达（P<0.05）。蛋白水平表达与mRNA水平一致。此外,免疫沉淀实验及质谱分析结果显示KIAA1199可以与WBP11和PTP4A3结合并相互作用。KIAA1199表达水平可以影响WBP11-FGFR4-β-catenin轴和PTP4A3-EGFR轴（包括p-EGFR,STAT3和p-STAT3）一些关键分子的蛋白的表达水平。更重要的是,当在KIAA1199过表达模型中干扰WBP11和PTP4A3后,显著削弱了KIAA1199对胃癌细胞迁移和WBP11-FGFR4-β-catenin轴和PTP4A3-EGFR轴（包括p-EGFR,STAT3和p-STAT3）一些关键分子的蛋白表达水平的影响。这些结果提示KIAA1199可能通过与下游效应分子WBP11和PTP4A3相互作用,激活FGFR4/Wnt/β-catenin和EGFR信号通路来调节胃癌转移。4.KIAA1199在胃癌中表达上调的分子机制4.1 MiR-29c-3p在胃癌组织及细胞中的表达及与KIAA1199靶向关系的验证鉴于miRNA可以调控基因的表达,我们将TCGA数据库中胃癌基因表达数据与TargetScan数据结合,找出既能靶向KIAA1199又在胃癌中下调,并与KIAA1199表达呈显著负相关的miRNA。最终,我们观察到miR-29c-3p与KIAA1199有两个结合位点,并在胃癌组织及细胞中表达显著下调（P<0.01）,与KIAA1199表达呈显著负相关（P<0.001）。并且双荧光素酶实验证实miR-29c-3p能与KIAA1199-3’-UTR结合,过表达miR-29c-3p显著抑制胃癌细胞中KIAA1199的mRNA和蛋白水平,但当作用于KIAA1199 CDS区时却不能影响KIAA1199的表达。这些结果提示miR-29c-3p通过与KIAA1199-3’-UTR结合,并发挥转录后调控作用。4.2 MiR-29c-3p在胃癌转移中的作用及机制并与KIAA1199的联系为了进一步研究miR-29c-3p与KIAA1199在功能和机制上的联系,在体外,Transwell实验结果显示,当miR-29c-3p过表达时显著抑制胃癌细胞迁移;在体内,裸鼠移植瘤模型、腹腔播散模型及远端肺转移模型结果显示,过表达miR-29c-3p同样能够抑制胃癌的生长和转移。并且在过表达miR-29c-3p组的肺转移灶中发现miR-29c-3p的表达显著高于对照组,而KIAA1199的表达呈现相反的模式。在机制上,我们发现miR-29c-3p过表达显著降低KIAA1199的mRNA和蛋白水平,miR-29c-3p抑制可增加KIAA1199的蛋白表达。另外,我们注意到miR-29c-3p过表达可以显著降低N-cadherin和FGFR/Wnt/β-catenin和EGFR信号通路（WBP11、PTP4A3、FGFR4和EGFR）等关键蛋白的表达水平;增加E-cadherin的表达水平。更重要的是,当KIAA1199与miR-29c-3p同时过表达时,KIAA1199对胃癌细胞迁移、FGFR/Wnt/β-catenin及EGFR信号通路（WBP11,PTP4A3、FGFR4和EGFR）等关键蛋白的影响被显著抑制。整体而言,这些结果表明miR-29c-3p可能通过调控KIAA1199表达调节Wnt/β-catenin和EGFR信号通路,从而调控细胞迁移。研究结论1.KIAA1199在胃癌中表达上调,其水平与胃癌进展、淋巴结转移、术后复发和生存率显著相关。2.KIAA1199可以通过调节细胞凋亡促进胃癌细胞的增殖。3.KIAA1199通过与下游效应分子（WBP11和PTP4A3）相互作用,激活FGFR4/Wnt/β-catenin和EGFR信号通路,从而调节胃癌转移。4.KIAA1199是miR-29c-3p的靶基因,miR-29c-3p可以通过调控KIAA1199表达,影响Wnt/β-catenin和EGFR信号通路,从而调控细胞迁移。研究意义本研究系统筛选了胃癌中差异表达的mRNA,并通过体内外实验证明了KIAA1199在胃癌增殖、转移中的重要作用,详细阐述了KIAA1199在胃癌中通过与WBP11及PTP4A3结合并相互作用、激活Wnt/β-catenin和EGFR信号通路,进而调控胃癌细胞增殖、转移新机制,并证明在胃癌中,KIAA1199表达可以被miR-29c-3p调控。本研究为抑制KIAA1199诱导的胃癌提供了新的途径,并为胃癌的靶向治疗提供了新的治疗策略。