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IFN-τ属于Ⅰ型干扰素,只在反刍动物的胚胎滋养层中分泌,作为反刍动物妊娠的识别信号,具备Ⅰ型干扰素功能,还有独特的抗黄体溶解及低细胞毒性特点,已逐渐成为研究热点。它作为一种旁分泌因子与子宫内膜的受体结合,发挥重要的生物学功能,其中包括对Ⅰ类组织相容性复合体分子(MHC-I)的免疫调节。先前的研究已表明在羊上皮细胞中IFN-τ能够促进MHC-I的表达,但IFN-τ调控奶牛Ⅰ类组织相容性复合体分子(BoLA-I)的免疫机制目前尚未见报道。基于IFN-τ的免疫调控报道较少,本试验首先采用脂多糖(LPS)刺激RAW264.7巨噬细胞和建立小鼠急性肺损伤模型探索IFN-τ的抗炎机制;然后通过添加不同浓度的IFN-τ刺激奶牛子宫内膜上皮细胞,寻找IFN-τ的最佳作用浓度;选取最佳浓度的IFN-τ刺激奶牛子宫内膜上皮细胞,采用生物信息学技术预测及分析差异表达的miRNAs与BoLA-I的潜在靶向关系,利用双荧光素酶报告实验验证靶基因,并对其进行功能研究。阐明IFN-τ调节奶牛子宫内膜上皮细胞表达BoLA-I的分子机制,为提升奶牛繁殖力提供理论基础和科学依据。1.IFN-τ的抗炎机制研究IFN-τ属于Ⅰ型干扰素,只在反刍动物的胚胎滋养层中分泌,作为反刍动物妊娠的识别信号。众所周知,Ⅰ型干扰素在免疫调控方面发挥至关重要的作用。已有文献报道了 IFN-τ在炎性疾病中起作用,但是目前关于IFN-τ在细菌内毒素致病方面的研究罕见。LPS被广泛用于诱导急性肺损伤模型,该模型常作为一种临床前抗炎药物的评估及筛选。因此,LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞和建立小鼠急性肺损伤模型用于IFN-τ的抗炎功能研究。试验结果发现IFN-τ减轻LPS引起的肺损伤也许是通过抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活来降低炎性反应的。2.IFN-τ调控BoLA-I表达的miRNA文库分析及验证为了深入研究IFN-τ对BoLA-I分子的免疫作用机制,本试验在培养的原代奶牛子宫内膜上皮细胞中添加一定浓度不同作用时间点的IFN-τ,采用高通量测序技术建立IFN-τ在奶牛子宫内膜上皮细胞中特定的miRNA文库,并进行数据分析。根据GO基因富集和KEGG注释分析,选取了 bta-miR-148b/152对其进行靶基因的验证及其功能研究,为后续阐明IFN-τ调控BoLA-I分子表达机制的探索奠定基础。试验结果显示IFN-τ在200 ng/mL时的作用最显著,MTT试验也检测了该浓度下的IFN-τ对细胞活力无影响。为了验证bta-miR-148b/152的表达是否参与到BoLA-I 分子的调控,TargetScan 7.1、mircorna.org 等用于对 bta-miR-148b/152 的靶基因进行预测。双荧光素酶试验及miRNA mimics、inhibitors转染试验发现bta-miR-148b/152 与 BoLA-I heavy chain 呈负相关关系。3.bta-miR-148b/152在奶牛子宫内膜上皮细胞的靶基因功能研究为了进一步验证高通量测序数据分析结果,并探讨IFN-τ对BoLA-I分子的免疫功能相关信号通路的影响,本试验通过原代奶牛子宫内膜上皮细胞及其细胞系对bta-miR-148b/152的靶基因功能进行研究。结果显示,LPS刺激下沉默的BoLA-I heavy chain增加了 TLR4及其下游信号通路的表达水平。Fps/SHP-2通路在免疫过程中也发挥重要作用,于是我们通过Western blot和RNA干扰技术检测了它们的表达情况。结果显示,BoLA-I分子交联后提高Fps和SHP-2的表达。此外,Fps基因被干扰后,在LPS刺激下,SHP-2的磷酸化减少,随后炎性细胞因子的分泌增加。当前研究表明Fps与SHP-2关联通过BoLA-I分子抑制TLR4诱导的炎性反应。我们的数据揭示BoLA-I分子负调控TLR4诱导的炎症反应也许是通过Fps-SHP-2通路实现的。