随着糖尿病发生率的不断增高，糖尿病皮肤溃疡也日益成为外科医生共同关注的焦点之一。其中，溃疡发生的部位以足部为多。国际糖尿病足病工作组(IWGDF)将糖尿病足病定义为糖尿病患者踝以下累及全层皮肤的创面，而与这种创面的病程无关。糖尿病是目前全世界第三大常见疾病(心脏血管病、肿瘤、糖尿病)，国外，糖尿病患者并发糖尿病足的机会高达15％，中山大学附属第一医院的一项临床研究显示，住院糖尿病患者并发糖尿病溃疡的发生率达到了2.058％。糖尿病足也成为皮肤慢性溃疡的重要组成及代表。 糖尿病足给病人及社会带来了沉重的经济负担。据文献报道，在美国，糖尿病性足部溃疡每年费用达15亿美元，在英国每年用于糖尿病足溃疡的治疗的费用达1.7亿英镑，这些费用仅包括换药治疗和社区医护人员支出，而并不包括由此而来的病人生活质量下降、经济受损等后果；在国内，虽然没有关于类似的统计资料，但随着糖尿病足的发病率逐年上升，医院及社会在此方面的支出也在逐年增长。 糖尿病足不仅增加了病人和社会的经济负担，而且，糖尿病溃疡创面的存在，轻则增加病人痛苦，影响正常工作和生活；重则危及生命。大面积溃疡创面的存在，可以影响机体的代谢、营养和免疫功能，甚至招来致命性的全身性感染。由于血液供应差，且多有神经病变，糖尿病足溃疡伤口愈合缓慢、临床治疗困难。出现坏疽机会较正常人群为高，往往需要进行截肢手术。而有些病人截肢后伤口仍不能愈合，不得不接受再次截肢手术。据统计，一侧截肢的病人在第2年对侧肢体截肢率高达30％，造成病人极大痛苦。因此促进溃疡愈合，尽快地封闭创面，是临床治疗中的重要课题。 随着对创面愈合认识的深化，人们认识到，打破慢性创面的停滞状态，使病理愈合模式向生理愈合模式转变，是治疗慢性创面的基本原则；治疗工作及研究已从被动等待状态转向主动调控。 近年来，随着对创面愈合过程的不断深入，学者们纷纷认识到，打破慢性创面的停滞状态，启动创面的愈合的过程，需要针对创面不同的原发病，以及针对创面的不同时期，进行有针对性的治疗。本世纪初，美国学者首先提出来“创面床准备(Wound Bed Preparation，WBP)”理论，成为创面处理理论方面的里程碑。本课题组在既往的工作中，运用WBP理论，已做了大量有益的尝试，取得了一定的成绩。 本课题即是在此背景下，在以往的工作基础上，对WBP理论指导创面治疗进行有益的尝试。 实验目的： 本研究将在既往研究的基础上进一步研究：1、在充分创面床准备条件下，体外诱导及培养大鼠外周血单个核细胞为内皮祖细胞(Endophilial Progenitor Cell，EPC)，并将同源内皮祖细胞移植于大鼠糖尿病溃疡创面对愈合的影响。2、胰岛素样生长因子(Insulin—like Growth Factor-1，IGF-1)提纯、扩增及鉴定，为进一步研究做前期准备。 实验方法：本实验共分二部分。 第一部分：同源内皮祖细胞(EPC)移植于大鼠糖尿病溃疡创面对愈合的影响。①大鼠外周血内皮祖细胞的体外诱导及鉴定：用Ficoll—Paque离心法，分离Wister大鼠外周血单个核细胞，将分离得到的细胞置于含10％FCS、VEGF 10 ng·L-1、bFGF 2 ng·L-1的DMEM培养基中培养，以Flk-1和vW因子的免疫荧光鉴定培养细胞；②糖尿病溃疡大鼠动物模型的建立：3月龄雄性普通级Wistar大鼠10只，体重200～250 g。以四氧嘧啶法，复制糖尿病模型，并制造溃疡创面，以模拟糖尿病慢性创面红期阶段进行实验研究；③同源内皮祖细胞移植于大鼠糖尿病溃疡创面，通过实验研究了解效果。即：观察创面愈合时间；创面全愈当天处死大鼠，取原创面组织切片，行VEGF免疫组化染色，NIKON80i光学显微镜下照相，NIKON ACT-2u软件摄入电子计算机；以Image Pro Plus 6.0图像分析软件对创面VEGF在照片视野中的面积、累积光密度进行分析，反映VEGF含量变化; PHILIPS CM10透射电镜对创面组织结构电镜观察。此步骤以5只正常大鼠皮肤组织做正常对照。第二部分：胰岛素样生长因子1(IGF-1)真核细胞表达质粒的构建：Trizol自人肝脏组织提取cDNA，RNA，经RT-PCR、PCR扩增，电泳鉴定目标DNA；大肠杆菌感受态细胞制备、酶切鉴定目标基因质粒。 结果： 经过研究，课题组达到了预期的研究目的：(1)成功地将大鼠外周血单个核细胞诱导分化为内皮祖细胞，并利用免疫荧光的方法对其进行鉴定；(2)复制了稳定的糖尿病溃疡大鼠动物模型。实验结果发现，适当剂量的四氧嘧啶(150mg／kg)可安全地复制糖尿病大鼠模型；控制血糖在11-14mmol／l对维持模型的存活是安全的；(3)局部移植EPC于模型，其愈合速度加快，组织中VEGF含量显著增高，血管增生明显；电镜下血管内皮结构良好。证实EPC对创面愈合有促进作用。(4)成功构建pMDl8-T-hIGF-1质粒，为进一步研究IGF-1对慢性创面的愈合作用提供了实验基础。 结论①利用Ficoll-Paque离心法可以经济有效地自外周血单个核细胞中分离并诱导培养内皮祖细胞；本实验在体外诱导大鼠外周血单核细胞分化为内皮祖细胞，为移植自体大鼠内皮祖细胞的研究打下了基础。②适当剂量的四氧嘧啶(150mg／kg)单次腹腔内给药，可安全地复制糖尿病大鼠模型；控制血糖在11-14mmol／l对维持模型的存活是安全的：③EPC局部移植可以促进糖尿病足慢性创面的愈合，其可能的原因是EPC移植，促进了VEGF分泌，增加了创面的微血管，改善了局部的微循环；④成功构建pMD18-T-hIGF-1质粒，为进一步研究pMD18-T-hIGF-1慢病毒转染、修饰EPC后，其对创面修复作用的研究奠定了实验基础。本研究在于将临床与实验结合，从本学科研究的热点问题出发，尝试运用内皮祖细胞这一安全、易取得的干细胞治疗慢性创面；从干细胞治疗方面，完善创面床准备理论在实践中的应用。同时，克隆鉴定了人IGF-1基因，为本课题的后续研究创造了有利的条件。