拟态弧菌（Vibrio mimicus）是一种重要的水生动物病原菌,与霍乱弧菌（Vibrio cholera）亲缘关系最近,曾被误认为是同种病原,可致人类急性霍乱样腹泻或痢疾样腹泻,给公共卫生安全也带来严重威胁。拟态弧菌作为严重危害淡水鲇形目鱼类的新发现病原菌,其感染具有病程短和死亡率高的流行特征,给我国淡水鲇养殖造成严重的经济损失。免疫预防或成为防控该病最为有效手段,基因缺失减毒疫苗被认为是鱼类疫苗开发的重要发展方向,而构建基因缺失减毒疫苗的前提是对拟缺失靶基因功能的明确。目前,对鲇源拟态弧菌的基因组学及其致病相关的功能基因尚不完全清楚。为此,本研究以鲇源拟态弧菌强毒株（SCCF01菌株）为研究对象,进行全基因组测序和比较基因组分析,并在了解基因组遗传信息的基础上,采用Natural transformation技术构建三种毒力基因的缺失株,通过比较缺失株和野生株生物学特性,以深入揭示缺失靶基因功能,以期为基因缺失减毒疫苗的研发奠定理论基础。论文中具体研究结果如下:1.拟态弧菌SCCF01菌株全基因组测序注释及组分分析提取SCCF01菌株的基因组DNA,在DNA样品的完整性、纯度和浓度质控检测合格的基础上,构建DNA测序文库,采用PacBio RS II测序平台进行测序。下机数据进行Denovo组装,获得了两个完整的环状染色体基因组序列。两个染色体序列的长度分别3,213,040 bp和1,270,975 bp,GC含量46.61%和45.88%,获得NCBI登录号分别为:CP016383（1号染色体）和CP016384（2号染色体）。随后,利用COG、GO、KEGG、ARDB和VFDB等数据库对两个基因组序列进行功能基因、耐药基因和毒力基因注释,并绘制基因组圈图。通过功能基因注释获得SCCF01菌株各个基因的功能、分类和代谢途径等相关信息,基因组圈图展示SCCF01菌株的基因组特征,耐药基因数据库注释共发现20个耐药相关的基因,毒力数据库注释获得SCCF01菌株基因组中粘附素、鞭毛系统、外毒素和分泌系统等毒力基因信息。最后,使用Prodigal、barrnap、tRNAscan-SE、RepeatMasker、IslandViewer和PHAST等软件进行基因组组成分析,预测显示SCCF01菌株的基因组中共含有31个rRNA和106个tRNA,并获得基因组中的重复序列、基因岛和前噬菌体的相关预测信息。2.拟态弧菌SCCF01菌株比较基因组学分析为解析SCCF01菌株的进化来源和变异情况,对SCCF01菌株与其他拟态弧菌进行共线性比较分析、基因家族分析、SNP注释和系统进化分析。共线性分析获得SCCF01菌株基因组与拟态弧菌典型株（ATCC33654和ATCC33655）全基因组的线性关系,但无法判断亲缘关系;基因家族分析预测拟态弧菌SCCF01菌株可能的进化方向为:临床菌株→环境菌株→SCCF01菌株;SNP注释和系统进化分析结果显示SCCF01菌株与环境菌株具有更近的亲缘关系;因此结合基因家族分析、SNP注释和系统进化分析的结果推测SCCF01菌株可能来源于环境菌株。另外,对拟态弧菌进行种属差异整体比较,获得SCCF01菌株在种属间的整体差异列表;Core-Pan基因分析获得了SCCF01菌株与其他拟态弧菌的共有和特有基因关系;SV检测和Indel检测获得了SCCF01菌株与其他拟态弧菌基因组DNA结构变异情况。最后,基于基因组对常见弧菌构建系统发育树,结果显示SCCF01菌株与拟态弧菌的标准株聚为一簇,进一步在基因组水平证实SCCF01菌株属拟态弧菌。3.拟态弧菌SCCF01菌株基因缺失株的构建与鉴定基于全基因组序列采用Natural transformation技术分别对溶血素基因、II型分泌系统（Type 2 Secretory System,T2SS）基因簇和两个TonB系统进行重组缺失,分别获得三种毒力基因（簇）缺失的重组株;随后利用PCP20质粒对重组株中的抗性基因筛选标记进行剔除,获得对应的缺失株。进一步使用PCR技术、第一代测序技术、RT-PCR技术对构建的重组株和缺失株进行基因水平和转录水平的鉴定。PCR鉴定结果显示所有重组株和缺失株中的靶基因均被敲除,所有重组株中的抗性基因均被PCP20质粒剔除获得对应的缺失株,FRT位点检测结果显示引物扩增出缺失株的目的条带大小正确,所有缺失株均不含有PCP20质粒的残留;第一代测序技术结果表明缺失株的上下游同源臂均能与野生株匹配且缺失靶基因已被敲除;对缺失靶基因RT-PCR结果表明缺失株在RNA转录水平不含有缺失靶基因,且缺失靶基因的上下游开放阅读框基因的均能正常转录。最后,通过对缺失株进行传代培养（共50代）证实缺失株能在传代过程中稳定遗传。上述结果从基因和转录水平证实SCCF01菌株T2SS基因簇、溶血素基因和两个TonB系统的基因缺失株被构建成功。4.拟态弧菌SCCF01菌株基因缺失株的表型特征研究将构建成功的T2SS基因簇、溶血素基因和两个TonB系统的缺失株与野生株进行表型特征比较。结果显示,三种毒力基因（簇）缺失后菌体形态和生理生化特性未发生明显变化,但其在Luria-Bertani琼脂和TCBS琼脂上的菌落形成大小和被膜生成率均极显著低于野生株（P<0.01）。T2SS基因簇缺失后其在液体培养基的生长速率、自聚集能力和对EPC细胞的粘附能力均极显著低于野生株（P<0.01）;但溶血素基因和两个TonB系统缺失后生长速率、自聚集能力和对EPC细胞的粘附能力与野生株差异却不显著（P>0.05）。T2SS基因簇和TonB系统缺失菌株在软琼脂的运动能力极显著低于野生株（P<0.01）。将不同浓度的缺失株和野生株浸泡感染黄颡鱼,考察各基因（簇）在致病中的作用。结果显示,溶血素基因缺失后半数致死量(Lethal Dose 50%,LD₅₀)与野生株无明显差异,但T2SS基因簇和TonB系统缺失后LD₅₀明显升高,减毒倍数分别为307.26（缺失T2SS基因簇）、26.61（缺失TonB1系统）、81.75（缺失TonB2系统）和141.25（缺失TonB1系统和TonB2系统）。最后将T2SS和两个TonB系统进行联合基因缺失后进行致病性试验,结果显示联合基因缺失株LD₅₀值为4.46E+07,减毒倍数高达668.34倍。5.T2SS对分泌蛋白、自然感受现象及TonB系统对铁利用的影响研究为进一步揭示拟态弧菌T2SS基因簇与TonB系统的功能,分别开展T2SS基因簇缺失后对蛋白分泌和介导自然转化现象影响及TonB系统对铁利用影响的研究。研究结果表明,T2SS基因簇缺失后,分泌的胞外蛋白位于15-25kDa（4条）、35-50kDa（1条）和50-70kDa（1条）间,蛋白含量均相较于野生株降低,此外分泌的胞外产物蛋白酶活性、卵磷脂酶活性和几丁质酶活性均显著低于野生株（P<0.05）;对缺失株的自然转化效率分析结果表明,T2SS基因簇缺失后不能形成自然感受态摄取外源DNA进行基因水平转移。TonB系统对铁利用的影响研究结果表明,对TonB系统缺失后对Fe²⁺、Fe³⁺和乳铁蛋白的摄取与野生株差异不明显,但对TonB1系统缺失后将显著降低对血红蛋白和血红素的摄取能力;2,2’-Dipyridyl敏感试验结果表明对TonB1系统或TonB2系统任何一个系统缺失后均能增加对菌株2,2’-Dipyridyl的敏感性。本章结合第五章表型特征研究进一步揭示了II型分泌性系统和TonB系统基因缺失后的减毒机制。综上,本论文通过第三代测序技术对拟态弧菌SCCF01菌株进行全基因组测序和分析;随后基于全基因组序列选择缺失靶基因和设计打靶载体引物,利用Natural transformation技术构建SCCF01菌株的II型分泌系统基因簇、溶血素基因和两个TonB系统基因的缺失株,并对其鉴定;最后通过比较野生株和缺失株的生物学特性验证是否减毒和揭示其减毒机制。SCCF01菌株全基因序列、缺失株的成功构建以及生物特性的研究将为基因缺失弱毒疫苗的研制提供物质基础与理论依据。