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第一部分:ARPP-19在神经胶质瘤中的表达和意义目的神经胶质瘤是人类中枢神经系统最常见的原发肿瘤,其中高级别胶质瘤恶性程度高,预后很差,5年生存率不到10%。至今为止,神经胶质瘤的发生、发展和生长的具体分子机制尚不清楚。ARPP-19是c AMP调节的磷蛋白19(c AMP-regulated phosphoprotein 19)的简称。它是alpha-endosulfine(ENSA阿尔法-内磺肽)家族体系中重要的成员之一,是所有哺乳动物脑部分布比较广泛的一个蛋白,作为蛋白激酶A的底物发挥生理作用。ARPP-19在中枢神经系统中发挥着重要信号调节的作用。研究表明,ARPP-19的异常表达会导致中枢神经系统疾病的发生,如导致神经系统肿瘤的产生、诱发阿尔兹海默症。近些年,人们逐步认识ARPP-19的生理功能,发现它对多种恶性肿瘤的发生发展具有促进作用。尽管最近的研究证明了ARPP-19在细胞有丝分裂以及肿瘤发生发展中发挥着一定作用,但是有关ARPP-19具体到在人神经胶质瘤中的作用及其异常表达的临床意义至今尚无报道。特异性周期蛋白D1(cyclin D1)可以促进细胞增殖,如过度表达则会导致细胞增殖失控。c-myc基因定位与8q24,是myc基因家族一员。c-myc与正调节的生长因子协同促进细胞增殖,而与具有负调控的生长抑制基因结合后可加速细胞凋亡。cyclin D1和c-myc均与细胞生长周期相关,故我们选择两者以了解ARPP-19如何调节cyclin D1和c-myc基因的表达,来推测ARPP-19在肿瘤细胞增殖、转移过程中的作用。为此,本研究旨在明确ARPP-19在人神经胶质瘤中的表达及其临床意义;为了探索ARPP-19在神经胶质瘤中发挥作用的机制。方法选择人的神经胶质瘤细胞系A172用来做体外细胞实验研究。将合成ARPP-19的si RNA转染A172人神经胶质瘤细胞系。通过实时定量RT-PCR定量检测转染ARPP-19的si RNA以后的ARPP-19 m RNA水平的的表达;通过细胞软琼脂克隆形成实验检测转染ARPP-19 si RNA的A172细胞的增殖、非锚定依赖生长和肿瘤细胞的恶性行为,通过Transwell小室和细胞划痕创伤愈合实验检测转染了ARPP-19的si RNA的A172细胞迁移及侵袭能力,应用Western Blot实验检测转染了ARPP-19的si RNA的A172细胞和对照组NC的神经胶质瘤细胞中Cyclin D1和c-myc蛋白表达的变化,同时选择β-ACTIN作为内部参照基因作蛋白上样量平衡。利用免疫组织化学技术检测安医大二附院2009-2015年间81例神经胶质瘤石蜡标本的ARPP-19蛋白的表达水平,通过门诊或电话随访患者并收集无病生存和总生存的相关数据,使用皮尔森卡方检验和卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier curves)分析ARPP-19与患者的无病生存率(RFS)和总生存率(OS)之间的相关性。结果在转染了ARPP-19的si RNA后A172细胞中,ARPP-19的m RNA表达明显下降。ARPP-19被si RNA敲低以后五天之内的细胞生长曲线显示A172细胞的生长数目明显降低,软琼脂克隆形成率明显降低,转移能力和侵袭能力也有了很大程度的降低划痕创伤愈合能力也被大大削弱。关于下游机制,Western Blot实验显示当A172细胞的ARPP-19的表达水平被敲低以后,cyclin D1和c-myc的表达水平也相应降低。81例胶质瘤患者中,高级别胶质瘤43例,低级别38例。临床病理资料显示ARPP-19的表达水平与神经胶质瘤的肿瘤高分级具有显著相关性,而与年龄、性别、KPS评分的相关性不显著。ARPP-19在高级别神经胶质瘤中的表达水平明显高于低级别神经胶质瘤(ARPP-19 P=0.001),ARPP-19高表达的神经胶质瘤患者的无病生存率(RFS)以及整体生存率(OS)明显低于ARPP-19低表达患者(RPF P=0.002;OS P=0.001)。结论ARPP-19能够促进神经胶质瘤的增殖和转移,可能是是通过正向调节cyclin D1和c-myc的表达而发挥作用。ARPP-19的蛋白表达水平与神经胶质瘤患者的预后具有显著正相关性,即高表达患者预后差,低表达患者预后好。提示ARPP-19可能作为神经胶质瘤患者疾病进展和生存预测的生物指标。第二部分:LC3B,p62在神经胶质瘤中的表达和意义目的细胞自噬autophagy是真核生物中进化保守的、依赖溶酶体途径的、对胞质蛋白和细胞器进行降解、对细胞内物质进行周转的重要过程。自噬是维持细胞稳定性和代谢平衡的一个基本生理代谢机制;同时,细胞自噬在促进多种肿瘤的发生、发展以及抗肿瘤治疗耐受方面也发挥着重要作用。近年来在多种肿瘤中发现自噬的增强或减弱:一方面,细胞自噬可能抑制肿瘤的发生,自噬水平的下降也导致肿瘤的恶化和进展,因此恶性肿瘤则表现为自噬降低。另一方面,自噬使肿瘤细胞迅速降解过多错误表达的蛋白质以适应恶性生长的需要、或者免受饥饿、化疗、放疗所导致的损伤而持续生存。导致自噬促进肿瘤细胞对恶性环境的适应,表现为自噬增高。文献显示,细胞自噬一般参与了神经胶质瘤的恶性发展过程。文献报道,在细胞自噬生理过程中自噬小体的形成是关键的步骤,而微管蛋白1轻链3(microtubleassociated protein 1 light chain3,MAP1LC3,简称LC3)是编码自噬相关蛋白的重要基因,其编码形成自噬小体膜的重要蛋白,因此,在细胞自噬的研究过程中,人们常将LC3蛋白作为一个标志物来衡量细胞自噬的程度、频度等。但LC3蛋白在其中发挥的具体作用我们还知之甚少,即LC3参与了增强自噬的过程还是降低自噬的过程。LC3蛋白包含三个亚基(LC3A,LC3B,LC3C),一般通过检测LC3B亚基来衡量整个LC3表达水平。同时根据LC3B的表达水平观察其形成的自噬小体在胶质瘤中的作用。在细胞自噬中还有一种蛋白发挥着关键作用,它就是p62。Sequestosome 1(p62/SQSTM1)是一种由应激诱导产生的细胞内蛋白并作用于选择性自噬。p62包含多种蛋白作用域,可作为将要被自噬作用降解的小泡的受体,也可作为要被清除的泛素化蛋白聚集物的受体。p62蛋白可结合泛素,也可与LC3结合,从而靶向自噬体并促进泛素化蛋白的清除。p62作为细胞自噬生理过程中一些酶作用过程中不可或缺的底物,在信号转导过程中发挥重要作用。现有文献已知P62在恶性肿瘤中的高表达与肿瘤的发生、发展、恶性行为及病人预后差高度相关。本研究拟检测神经胶质瘤标本LC3B和p62蛋白表达水平,并分析它们与各临床病理参数以及病人的生存率之间的相关性。了解LC3B在胶质瘤中的表达特点;同时了解作为参与自噬过程中自噬小体组建的LC3B和参与自噬降解过程中的底物的p62在神经胶质瘤中的相关性。方法收集安医大二附院2009-2015年间81例经胶质瘤的石蜡固标本,利用免疫组织化学技术检测LC3B,p62蛋白的表达水平;通过电话随访和门诊随访的方式统计上述病人的无病生存和总生存情况。使用皮尔森卡方检验,卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier curves)分析它们与各临床病理参数以及与病人的无病生存率(RFS)和总生存率(OS)之间的相关性。结果81例胶质瘤患者中,高级别胶质瘤43例,低级别38例。LC3B和p62的表达水平与神经胶质瘤的肿瘤高分级具有显著相关性,而与年龄、性别、KPS评分的相关性不显著。相对于低级别胶质瘤,LC3B和p62在高级别的神经胶质瘤组织中为高表达(LC3B P=0.015,p62 P=0.002)。LC3B蛋白表达水平较高的病人,与LC3B蛋白表达水平较低的病人相比表现出更低的3年无病生存率(RFS)(P=0.044)和3年整体生存率(OS)(P=0.022)。LC3B与p62蛋白二者之间皮尔森相关性系数是0.274。结论在神经胶质瘤中,LC3B参与的细胞自噬促进了肿瘤的恶性发展过程。同时LC3B和p62在神经胶质瘤中的表达水平和患者预后具有正相关性,提示LC3B和p62可能在神经胶质瘤中协同发挥作用,共同促进神经胶质瘤的肿瘤发生、发展和恶性进程。