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目的 成熟神经元损伤后不能再生,因此提高神经元生存能力,促进神经元轴突和树突再生,及增强神经元对损伤耐受能力的研究愈来愈受到重视。临床上青光眼等疾病引起的视神经损伤通常给予B族维生素治疗。近年来的研究表明,该类药物通过发挥它们的生化辅酶活性和/或一些特殊功能,来维持神经系统的正常作用。但B族维生素对视网膜神经节细胞(RGCs)的影响未见报道,对低糖损伤的视网膜神经元的保护作用也未见报道。此外,最近的研究表明热休克蛋白70(HSP70)的诱导表达可提高神经元对损伤的耐受力,这提示我们要进一步寻找治疗视网膜神经元损伤的新方法。本研究的目的是证实B族维生素作为临床常规视神经保护剂的作用,指导该类药物的临床应用;观察HSP70的诱导和表达,及其对低糖和谷氨酸兴奋毒性损伤视网膜神经元和RGCs的保护作用,阐明视神经保护的新途径——提高神经元对损伤的耐受能力。 方法 采用大鼠视网膜神经元体外原代短期培养技术,系统地观察维生素B族,包括维生素B1(硫胺素)、维生素B6(吡哆醇)、维生素B12(氰钴胺)及弥可保(甲钴胺)对视网膜神经元及RGCs生存及轴突再生伸长的影响。同时观察了上述维生素对低糖引起的视网膜神经元损伤的保护作用。最后观察了HSP70在Müller细胞和视网膜神经元中的表达,及HSP70对低糖和谷氨酸兴奋毒性损伤的保护作用。 由于抑制了非神经元细胞的生长,因此可以较准确地评价神经元对各种影响因素的反应;测定细胞活力采用四唑盐(MTT)比色法,可间接反映细胞生存情况;对低糖引起的细胞损伤通过检测乳酸脱氢酶(LDH)的释放量进行评价。鉴定RGCs和Müller细胞采用相应细胞特异性抗原的免疫细胞化学技术;对数据进行合理的统计学处理。 为进行系列研究,首先建立新生大鼠视网膜神经元、RGCs和Müller细胞体外培养体系。对B族维生素的神经营养和保护作用的研究过程分为三个阶段,首先确定维生素B族对视网膜神经元是否有神经营养作用,并根据细胞活力找出最佳有效作用浓度;然后在接种细胞的即刻用各种维生素的最佳有效作用浓度作用于视网膜神经元,并在不同时间终止培养,收集细胞,HE染色和RGCs的免疫细胞化学染色,分别测量视网膜神经元和RGCs的轴突长度,评价维生素B族是否有促进视网膜神经元和RGCs轴突再生伸长的神经营养作用;最后,观察视网膜神经元对低糖损伤的反应,及维生素B族对受损的细胞是否有保护作用。此外,建立新生大鼠中文摘要M创Ier细胞体外培养体系,通过热休克诱导M训er细胞和视网膜神经元中日Sp70表达,并根据细胞存活能力评价日Sp7O是否能够提高视网膜神经元对低糖和谷氨酸兴奋毒性损伤的耐受力。 结果视网膜神经元有聚集成簇生长的趋势。在培养的最初Zd,全视网膜神经元的轴突生长速度最快,平均约12林mld,随后轴突伸长停滞,呈现一个“平台”,第4d,又有快速伸长的趋势;与之相比,RGCs轴突再生伸长以第ld最快,其后速度逐渐下降,无明显“平台”现象。 B族维生素对高密度(4x105lem2)培养的视网膜神经元比低密度(2x105lem2)培养者有较好的神经营养作用。维生素Bl、B6、B12和弥可保的最佳有效作用浓度分别为100pM、100pM、lpM和lpM。 在低血糖环境中培养6h,视网膜神经细胞明显受损伤,表现为细胞活力的显著下降。从各种维生素的作用曲线上可见弥可保对细胞轴突伸长的促进作用最为明显。各种维生素对RGCs轴突伸长的作用与对照组相比,无统计学意义。而在低糖处理的同时给予B族维生素,可在不同程度上保护视网膜神经元免受低糖损伤,其中B:、B6和弥可保的作用较明显。 经过热休克预处理,HSP7O在MQller细胞和视网膜神经元中高效表达,其中在M。”er细胞的表达更为持久;HSP70的诱导表达提高了视网膜神经元在低糖或兴奋毒性损伤后的细胞活力。 结论B族维生素对体外培养的大鼠视网膜神经元和RGCs有不同程度的神经保护和营养作用。HSP70的诱导表达能够提高视网膜神经元对低糖或兴奋毒性损伤的耐受能力。