目的探讨高脂饲养对大鼠胰岛素敏感性的影响,观察胰岛素刺激的高脂饲养胰岛素抵抗大鼠骨骼肌蛋白激酶B(Akt/PKB)及其底物磷酸化AS160的表达水平,体脂含量变化及其意义;探讨PPAR-γ受体激动剂罗格列酮和AMPK激活剂二甲双胍对高脂饲养胰岛素抵抗大鼠骨骼肌Akt及磷酸化AS160、GLUT4蛋白表达水平的影响,研究二者对骨骼肌胰岛素敏感性的作用机制。方法雄性Wistar大鼠分为对照组、实验组,对照组给予标准饲料,实验组大鼠均给予高脂饲料,即脂肪占总热量比例为59%,主要为饱和脂肪酸的动物脂肪。各组饲养12周,之后实验组随机为高脂组、罗格列酮组以剂量为3mg/kg/d和二甲双胍组300mg/kg/d分别灌胃干预8周,对照组仍然给予标准饲料,其余组仍给高脂饮食。喂养期间监测大鼠体重和血糖水平,空腹血浆胰岛素和血脂水平,及葡萄糖耐量试验,测定内脏脂肪含量,评估胰岛素敏感性,测定骨骼肌葡萄糖摄取率。应用Western blot检测各组肌肉组织Akt及其底物AS160信号分子表达变化,检测各组肌肉组织GLUT4蛋白表达变化,研究PPAR-γ激动剂罗格列酮和AMPK-α激活剂二甲双胍对高脂诱导的大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的改善作用及其机制。结果(1)与对照组比较,高脂组大鼠体重增加49.6%(P＜0.05);空腹血糖增加41.4%(P＜0.05);服糖后2小时血糖升高85.2%(P＜0.01);口服葡萄糖耐量试验提示高脂饲养后餐后2小时葡萄糖分配受损(P＜0.05)。空腹血清胰岛素水平升高181%(P＜0.01);血甘油三酯和胆固醇升高172%和101.6%(均P＜0.01),内脏脂肪含量增加132.9%(P＜0.01),胰岛素敏感指数显著下降(P＜0.01)(见表1-1,表1-2)。与对照组比较,高脂组大鼠骨骼肌基础状态下葡萄糖摄取水平降低30.8%(P＜0.05),胰岛素刺激后大鼠骨骼肌葡萄糖摄取水平下降61.5%(P＜0.01),显示高脂组大鼠骨骼肌组织存在胰岛素抵抗。(2)与对照组比较,高脂组大鼠骨骼肌磷酸化Akt Ser473表达显著降低19.8%(P＜0.01),磷酸化AS160表达升高33%(P＜0.05),提示高脂饲养可以降调节大鼠骨骼肌磷酸化Akt Ser473表达,并且增加大鼠骨骼肌磷酸化AS160的表达。高脂组大鼠骨骼肌GLUT4蛋白水平较对照组显著降低30.4%(P＜0.01),而应用罗格列酮或二甲双胍后各组GLUT4蛋白水平与高脂组大鼠骨骼肌GLUT4蛋白水平分别升高31%和14.6%(P＜0.01)。(3)与高脂组相比,应用罗格列酮使大鼠血甘油三酯水平降低43%(P＜0.01),内脏脂肪含量减少39.0%(P＜0.05),葡萄糖糖耐量改善(P＜0.05)空腹血清胰岛素水平下降(P＜0.05)。应用罗格列酮使磷酸化Akt Ser473表达水平显著提高47.1%(P＜0.01),同时磷酸化AS160表达水平减低26.5%(P＜0.001)。(4)与高脂组相比,应用二甲双胍使血甘油三酯水平降低39.5%(P＜0.01),内脏脂肪含量减少41.8%(P＜0.05),糖耐量改善(P＜0.05),空腹血清胰岛素水平下降(P＜0.05),大鼠骨骼肌磷酸化Akt Ser473表达水平提高37.7%(P＜0.01),同时AS160表达水平减低20.6%(P＜0.001)。(5)应用罗格列酮后大鼠骨骼肌基础状态下和胰岛素刺激后葡萄糖摄取水平分别较高脂组增加26.7%,(P＜0.05)和75.2%,(P＜0.01)。应用二甲双胍后大鼠骨骼肌基础状态下和胰岛素刺激后葡萄糖摄取水平分别较高脂组增加25.4%,(P＜0.05)和78.9%,(P＜0.01)。结论高脂饮食可以诱导大鼠机体水平和骨骼肌水平的胰岛素抵抗。高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠体脂进行性增多可能降调节骨骼肌胰岛素信号通路中磷酸化Akt Ser473的表达水平,升高骨骼肌磷酸化AS160的表达水平,同时其骨骼肌细胞膜GLUT4蛋白水平较对照组显著降低,从而减少葡萄糖的转运,诱导大鼠产生胰岛素抵抗。本研究提示大鼠骨骼肌磷酸化Akt Ser473表达下调和大鼠骨骼肌磷酸化AS160的表达上调可能是高脂诱导大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的下游机制。罗格列酮和二甲双胍可能直接或间接通过调节骨骼肌胰岛素信号传导即增加骨骼肌胰岛素信号通路中磷酸化Akt的表达,降低骨骼肌磷酸化AS160的表达而改善胰岛素的敏感性。目的探讨在高脂饲养诱导的胰岛素抵抗大鼠骨骼肌内胰岛素调节的葡萄糖转运子-4(GLUT4)移位中,磷酸化AS160是否和14-3-3蛋白发生生理性的相互作用。方法高脂饲养(脂肪占总热量比例为59%,以饱和脂肪酸为主)雄性Wistar大鼠12周,喂养期间监测大鼠体重和血糖水平,空腹血浆胰岛素和血脂水平,及葡萄糖耐量试验,测定内脏脂肪含量,并行骨骼肌葡萄糖摄取试验评估大鼠胰岛素敏感性。分离并提取胰岛素抵抗大鼠骨骼肌制成肌细胞悬液,在同时设立普通小鼠IgG对照下,利用Agarose结合的微珠进行免疫吸附AS160抗体,然后把细胞悬液与微珠混匀孵育,溶液中的AS160就被吸附到微珠上。去掉上清液后,再利用去污剂将吸附在微珠上的蛋白洗脱下来,应用14-3-3蛋白抗体和AS160的抗体结合检测并分离这两种蛋白,采取免疫共沉淀结合Westernblot技术研究AS160与14-3-3蛋白之间的关系。结果(1)与对照组比较,高脂组大鼠体重增加(49.6%,P＜0.05);空腹血糖增加41.4%(P＜0.05);服糖后2小时血糖升高85.2%(P＜0.01);口服葡萄糖耐量试验提示高脂饲养后餐后2小时葡萄糖分配受损(P＜0.05)。空腹血清胰岛素水平升高181%(P＜0.01);血甘油三酯和胆固醇升高172%和101.6%(均P＜0.01),内脏脂肪含量增加132.9%(P＜0.01),胰岛素敏感指数显著下降(P＜0.01)(见表1-1,表1-2)。与对照组比较,高脂组大鼠骨骼肌基础状态下葡萄糖摄取水平降低30.8%(P＜0.05),胰岛素刺激后大鼠骨骼肌葡萄糖摄取水平下降61.5%(P＜0.01),显示高脂组大鼠骨骼肌组织存在胰岛素抵抗。(2)用此种大鼠骨骼肌肌细胞提取液与结合了AS160的微珠进行免疫吸附结果显示,结合了AS160的微珠可以将AS160与14-3-3共同吸附下来而且两种蛋白均被免疫印迹法检测到,而作为阴性对照的结合普通小鼠IgG的微珠却不能被免疫印迹法检测到。经胰岛素刺激后AS160抗体结合组洗脱液中AS160与14-3-3蛋白的表达水平均升高。结论在胰岛素刺激下长期高脂饲养诱导的胰岛素抵抗大鼠骨骼肌细胞中,AS160与14-3-3蛋白存在生理性的相互作用,胰岛素刺激可能增加AS160与14-3-3蛋白的相互作用。目的探讨胰岛素刺激的高脂饲养胰岛素抵抗(IR)大鼠骨骼肌解耦联蛋白3(UCP-3)和葡萄糖转运子-4(GLUT4)mRNA基因表达水平的改变,观察高脂饲养IR大鼠骨骼肌内甘油三酯(TG)含量改变及其意义;了解PPAR-γ激动剂罗格列酮和AMPK-α激活剂二甲双胍对高脂饲养诱导的IR大鼠骨骼肌UCP-3和GLUT4mRNA基因表达水平的调节和对IR的改善作用机制。方法雄性Wistar大鼠分为对照组、实验组,对照组给予标准饲料,实验组大鼠均给予高脂饲料,即脂肪占总热量比例为59%,主要为饱和脂肪酸的动物脂肪。各组饲养12周,之后实验组随机为高脂组、罗格列酮组以剂量为3mg/kg/d和二甲双胍组300mg/kg/d分别灌胃干预8周,对照组仍然给予标准饲料,其余组仍给高脂饮食。喂养期间监测大鼠体重和血糖水平,空腹血浆胰岛素和血脂水平,及葡萄糖耐量试验,测定内脏脂肪含量,评估胰岛素敏感性,测定骨骼肌葡萄糖摄取率。通过酶比色法测定各组骨骼肌TG含量,冰冻切片油红O染色法对骨骼肌染色。应用RT-PCR方法检测对照组、高脂饲养胰岛素抵抗组和应用罗格列酮组和二甲双胍组骨骼肌UCP-3mRNA和GLUT4mRNA的表达水平。结果(1)与对照组比较,高脂组大鼠体重增加(49.6%,P＜0.05);空腹血糖增加41.4%(P＜0.05);服糖后2小时血糖升高85.2%(P＜0.01);口服葡萄糖耐量试验提示高脂饲养后餐后2小时葡萄糖分配受损(P＜0.05)。空腹血清胰岛素水平升高181%(P＜0.01);血甘油三酯和胆固醇升高172%和101.6%(均P＜0.01),内脏脂肪含量增加132.9%(P＜0.01),胰岛素敏感指数显著下降(P＜0.01)。与对照组比较,高脂组大鼠骨骼肌基础状态下葡萄糖摄取水平降低30.8%(P＜0.05),胰岛素刺激后大鼠骨骼肌葡萄糖摄取水平下降61.5%(P＜0.01),显示高脂组大鼠骨骼肌组织存在胰岛素抵抗。(2)与对照组比较,高脂组大鼠骨骼肌UCP-3mRNA表达水平显著降低48.2%(P＜0.01),而应用罗格列酮或二甲双胍后各组UCP-3mRNA表达水平与高脂组相比较分别升高107.2%(P＜0.01)和97.5%(P＜0.01)。(3)高脂组大鼠骨骼肌GLUT4mRNA表达水平较对照组显著降低45.4%(P＜0.01),而应用罗格列酮或二甲双胍后各组GLUT4mRNA表达水平与高脂组大鼠相比较分别升高125.1%(P＜0.01)和149.7%(P＜0.01)。(4)高脂饲养12周导致大鼠骨骼肌中TG含量显著增高(P＜0.01)。与高脂饲养组比较,罗格列酮治疗组大鼠骨骼肌中TG含量显著降低(P＜0.05),二甲双胍组大鼠骨骼肌中TG含量显著降低(P＜0.05)。结论高脂饲养导致骨骼肌脂肪含量增加可能使骨骼肌UCP-3 mRNA和骨骼肌GLUT4mRNA表达水平显著降低,导致胰岛素敏感性降低。罗格列酮和二甲双胍可能部分通过减少骨骼肌TG含量,增加UCP-3 mRNA和GLUT4mRNA的表达减轻IR。