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Akt（蛋白激酶B）信号是调节细胞存活、生长、增殖、代谢和迁移等方面的主要通路，越来越多的研究表明，在多种肿瘤细胞中Akt信号经常失调，导致磷酸化Akt的过量表达，从而促进了肿瘤细胞的过度增殖、抗凋亡和转移性加强等性状。临床上，参与Akt信号的蛋白是多种肿瘤干预治疗的重要靶标。事实上，一些以这些蛋白为肿瘤治疗靶点的药物已经进入了临床试验阶段。在黑色素瘤的形成过程中，即从正常黑色素细胞到黑色素瘤细胞，再到恶性黑色素瘤细胞，Akt通路活性逐渐增加，但是其具体机制仍不明了。本文就黑色素瘤细胞恶性进展过程中Akt信号的调控机制进行了深入的探讨，并筛选出通过抑制Akt信号而发挥高效抗黑色素瘤作用的化合物。 在第一章中，我们针对Akt信号的上游分子，首先探讨了在磷酸酶PTEN(phosphatase and tensin homolog)未缺失或突变的黑色素瘤细胞中，下游激酶Akt的调控机制。通过增殖、粘附、迁移和浸润等方面，我们挑选出恶性程度差异最大、并且同一来源的一对黑色素瘤细胞株——B16F1和B16BL6小鼠黑色素瘤细胞。在这对细胞中，恶性程度高的B16BL6细胞磷酸化Akt的表达明显高于恶性程度相对较低的B16F1细胞。用PTEN特异性干扰、PTEN抑制剂以及PTEN基因序列测定的方法发现，B16F1和B16BL6细胞的PTEN基因并未缺失或突变，并且具有活性。另一方面，我们发现Akt的另一个上游蛋白NHERF1(Na+/H+exchange regulatory cofactor NHE-RF1，又称EBP50或SLC9A3R1)在这对细胞中的定位不同，并且发挥不同的功能:在B16F1细胞中，NHERF1表达在细胞核内，抑制了磷酸化Akt的表达，同时抑制了细胞体内肿瘤形成的能力;而在B16BL6细胞中，NHERF1表达在细胞浆中，促进了磷酸化Akt的表达，同时促进了细胞体外增殖和体内肿瘤形成的能力。在此基础上，我们进一步发现在这对细胞中，PTEN的定位与NHERF1的定位极为相似。通过NHERF1特异性干扰实验我们发现，B16BL6细胞胞浆表达的NHERF1阻止了PTEN从细胞浆到细胞核的转移，同时上调了磷酸化Akt的表达(主要是细胞核中的磷酸化Akt)，而这一过程需要PTEN磷酸酶活性存在。最后我们通过序列比对和免疫共沉淀实验证实，NHERF1蛋白可以与PTEN蛋白的PDZ结合结构域直接相互作用，这可能是NHERF1通过调节PTEN定位影响了细胞核内磷酸化Akt表达的原因。 在第二章中，我们进一步探讨了黑色素瘤细胞中Akt的亚型特异性功能。首先免疫荧光和Western blot实验表明，过表达的Akt1和Akt2存在于细胞浆中，而Akt3存在于细胞核中。Western blot和免疫共沉淀实验表明，只有过表达在细胞核中的Akt3被显著的磷酸化。同时干扰实验表明，只有干扰了内源性Akt3的黑色素瘤细胞的磷酸化Akt表达明显下降，说明黑色素瘤细胞中的磷酸化Akt主要来源于细胞核内Akt3的磷酸化，即Akt3被特异性的过度磷酸化。进一步，我们又通过特异性干扰各亚型Akt发现，干扰了Akt3的黑色素瘤细胞增殖和克隆形成能力显著下降，干扰了Akt1的黑色素瘤细胞的增殖和克隆形成能力有较少量的下降，而干扰了Akt2的黑色素瘤细胞没有明显变化。以上结果表明，与表达在细胞浆中的Akt1和Akt2相比，表达于细胞核的Akt3被过度磷酸化并在黑色素瘤细胞的发生及恶性进展过程中起到更关键的作用。 在第三章中，我们通过筛选得到了有机合成的化合物SBF-1，其对多种黑色素瘤细胞都有很高的增殖抑制活性。Western blot实验表明，SBF-1显著的抑制了黑色素瘤细胞中过度活化的Akt信号，并使黑色素瘤细胞阻滞在细胞周期G1期。进一步实验我们发现，SBF-1下调了Akt上游激酶PDK1的磷酸化。通过PDK1体外激酶和分子对接实验我们发现，SBF-1可能是通过和PDK1的底物结合位点形成了稳定的复合结构，抑制了PDK1的激酶活性，进而降低了磷酸化Akt的表达。为了检测SBF-1的体内抗黑色素瘤的活性，我们建立了小鼠腋下接种肿瘤模型。我们发现与临床药物顺铂相比较，SBF-1通过下调Akt通路活性，更有效的抑制了B16BL6黑色素瘤细胞的生长并且延长了小鼠的生存期，同时毒副作用明显小于顺铂。另外，我们还建立了小鼠足掌接种肿瘤的被动转移模型，发现化合物SBF-1可以有效的抑制B16BL6黑色素瘤细胞的体内转移及体外在fibronectin上的粘附能力，这可能是由于SBF-1通过下调磷酸化Akt从而抑制了黑色素瘤细胞表面整合素α4的表达。这些结果都表明，SBF-1可以有效的抑制黑色素瘤细胞的增殖和转移，具有治疗黑色素瘤的潜在价值。 综上所述，本论文首次发现在黑色素瘤细胞的恶性进展过程中，胞浆表达的NHERF1通过阻止PTEN的入核进一步激活了细胞核内的Akt信号，从而促进了黑色素瘤细胞的进一步恶性发展;此外，我们还发现了在黑色素瘤细胞中，各亚型Akt的定位不一。与Akt1和Akt2定位在细胞浆中不同,Akt3定位在细胞核中，而定位于细胞核中的Akt3更容易被磷酸化从而发挥促进黑色素瘤细胞发生发展的生物学功能。最后，我们筛选得到了一个通过抑制Akt信号而发挥高效抗黑色素瘤作用的化合物SBF-1,进一步证实Akt信号在黑色素瘤恶性进展中的作用，并为基于调控Akt信号治疗黑色素瘤提供了新的可能。