60Coγ射线对钛表面成骨细胞及p38MAPK信号通路的影响

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绝大多数颌面部恶性肿瘤患者术后存在软硬组织缺损,赝复体修复仍是目前颌面缺损的主要修复方式之一,种植体支持固位的赝复体可以大大提高修复效果。但是,颌面部恶性肿瘤患者往往需要术前或术后放疗,由于放疗后的骨组织活性显著降低,在放疗骨植入种植体失败的风险要远高于正常骨组织。近年来随着计算机快速成型技术的发展,可以在手术切除肿瘤的同期按设计植入种植体,然后再进行放、化疗,最终完成赝复体的制作,即放疗前的种植修复。为了阐明射线对钛表面成骨细胞生物学活性的影响以及射线改变成骨细胞分化能力的分子机制,本研究观察了60COγ射线对微弧氧化(MAO)、纯钛抛光(PT)和培养板(TC)表面MC3T3-E1细胞增殖、分化能力及成骨相关基因表达的改变,并进一步研究了射线对MC3T3-E1细胞p38MAPK信号通路的影响。所取得的主要研究结果如下:1.辐射剂量的筛选和MAO表面特性分析MC3T3-E1细胞接种于培养板表面24小时后进行60COγ射线照射。单次照射剂量为2,4,6,8,10Gy,未照射组作为对照。MTT实验证实从辐射后第3天开始,4Gy以上辐射剂量显著降低了培养板表面MC3T3-E1细胞的增殖能力。在含有Ca和P的电解液中对纯钛试件进行微弧氧化处理,所取得的MAO表面与PT表面相比,表面粗糙度增加,表面湿润性提高。2.60COγ射线对两种钛表面MC3T3-E1细胞增殖的影响MC3T3-E1细胞接种于MAO,PT,TC表面24小时后进行射线照射,单次照射剂量为2,4,6,8,10Gy,未照射组作为对照。辐射后第7天MTT法检测射线对细胞增殖能力的影响。结果显示:在3种表面,4Gy以上辐射剂量显著抑制了细胞的增殖。同一辐射剂量下,比较3种表面对MC3T3-E1细胞增殖率的影响时,在8Gy组,MAO表面的细胞增殖率高于TC表面(P<0.05);其余组别MAO表面的细胞增殖率均高于PT或TC表面,但是并没有统计学差异(P>0.05)。3.60COγ射线对两种钛表面MC3T3-E1细胞分化能力的影响MC3T3-E1细胞接种于MAO,PT,TC表面24小时后进行射线照射,单次照射剂量为4和8Gy,未照射组作为对照。分别对各组进行碱性磷酸酶(ALP)、胶原分泌、基质矿化及成骨相关基因表达的测定。结果显示:在3种表面,8Gy射线显著抑制了细胞胶原的分泌,但并未对其ALP活性有显著影响。在PT和TC表面,8Gy射线显著降低了细胞的基质矿化。RT-PCR结果表明:辐射后第16天,在3种表面,8Gy剂量显著抑制了OSX,COL-Iα1和OCN基因的表达。同一辐射剂量下,比较3种表面对MC3T3-E1细胞分化能力的影响时,在3个剂量组,细胞在MAO表面的胶原分泌高于PT或TC表面;而细胞在MAO表面的ALP活性均低于PT或TC表面。RT-PCR结果表明:在3个剂量组,对于ALP基因,总的表达趋势为TC>PT>MAO。4.60COγ射线对MC3T3-E1细胞p38MAPK信号通路的影响MC3T3-E1细胞接种于培养板表面24小时后进行射线照射。单次照射剂量为8,16Gy,未照射组作为对照。分别对各组进行细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)和基质矿化的测定。MTT实验证实16Gy射线完全抑制了MC3T3-E1细胞的增殖能力。并且,该剂量射线引起细胞ALP活性和基质矿化显著降低。细胞接种于培养板表面24小时后接受16Gy射线照射,未照射组作为对照。细胞培养第3、6、9天real-time PCR检测BMP2、BMP4基因mRNA水平表达,接受射线照射后1h、8h及细胞培养第3、9天Western Blot检测p38表达及其磷酸化水平。RT-PCR结果表明16Gy射线并未对细胞BMP2,BMP4基因mRNA水平产生明显影响。Western blot结果证实在不同的时间点,射线并未对p38总蛋白的表达产生明显影响。相比于对照组,在辐射后1小时,细胞p38的磷酸化水平明显增强,接着迅速下降。从第3天开始,16Gy照射组细胞p38的磷酸化明显下调;至第9天,这种下调更为显著。说明16Gy射线可能通过改变MC3T3-E1细胞p38的磷酸化水平,来抑制其成骨功能。结论:1.在3种不同的表面(MAO,PT,TC),射线对于MC3T3-E1细胞生物学活性的影响是相似的,为放疗前种植提供了理论依据。2.相同辐射剂量下,MC3T3-E1细胞在MAO表面的胶原分泌均高于PT表面,提示应尽量选择MAO种植体植入缺损区。3.16Gy射线可能通过改变MC3T3-E1细胞p38的磷酸化水平来抑制其成骨功能,从而为改善放疗后成骨细胞活性,提高放疗区种植体成功率提供了新的思路。
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