背景：　　 流行病学研究表明冠状动脉粥样硬化是西方发达国家中发病率和死亡率的首要原因。高胆固醇血症是动脉粥样硬化发病的重要原因和风险因素。临床试验的证据表明，通过饮食和/或药理学方法可以降低血浆胆固醇，减少心血管疾病的发病率和死亡率。实验研究发现，很多核受体超家族成员可以作为为减少高胆固醇血症和动脉粥样硬化的治疗靶点。这些核激素受体超家族的成员包括过氧化物酶体增殖物激活受体和肝X受体等。这些配体激活的转录因子通过调控特定的基因盒的表达来调节各种重要的代谢过程。　　 除了配体激活的转录因子，核受体家族还包括许多孤儿受体，其配体和生理功能尚不清楚。其中核受体NR4A就是重要的核孤儿受体超家族成员，包括Nur77(NR4A1)，Nurr1基因(NR4A2)和Nor-1(NR4A3)。NR4A与其他核受体家族成员相比，是一种“即早基因”，在各种环境刺激下能短暂和迅速被诱导反应。Nur77是NR4A家族中的成员，与该家族中其他核受体一样含有N-端的激活功能区域AF-1、带两个锌指结构的DNA结合域DBD以及C-终端配体结合域LBD。早期功能研究已经指出Nur77在调节分化，增殖和凋亡过程中起着关键作用。最近的研究表明Nur77在葡萄糖代谢和脂质代谢，脂肪形成，炎症反应以及血管重构中发挥重要的作用。最初的实验表明，Nur77能够促进肌肉中的脂肪水解。随后研究表明，Nur77可以调节小鼠血浆脂蛋白水平和肝脏脂质代谢。在最近的实验研究中发现，在高脂喂养Nur77缺陷小鼠中转录因子固醇调节元件结合蛋白1C(SREBP1C)的表达明显增加并出现明显的肝脏脂质蓄积。因此，本研究通过增强和抑制Nur77的表达，观察Nur77对apoE-/-小鼠主动脉粥样硬化病变的影响并探讨其相关的机制。　　 目的：　　 1、Nur77是否可以影响细胞胆固醇吸收，细胞内胆固醇成分以及细胞内胆固醇流出。2、Nur77是否可以影响apoE-/-小鼠血脂水平和循环中炎症因子水平。3、Nur77是否可以影响apoE-/-小鼠肝脏脂质代谢。4、Nur77是否可以影响肠对脂质吸收相关基因表达。5、Nur77是否可以影响apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变。　　 方法：　　 1、Nur77对THP-1巨噬细胞胆固醇吸收，对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞脂质成分和胆固醇流出影响的研究。　　 1.1THP-1细胞生长于含有10％新生小牛血清的RPMI-1640培养液中，37℃，5％CO2培养箱中静置培养。培养液中加100U/ml的青霉素和100μg/mL的链霉素。取对数生长期细胞进行实验，在每次实验前用100nM佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate，PMA)孵育THP-1细胞72h，使其诱导分化成巨噬细胞，更换培养基后加50mg/mlox-LDL孵育48h时期转化成泡沫细胞。　　 1.2PCR-XL-TOPO载体，pIRES2-EGFP载体，platinumHIFITaqPolymerase高保真扩增酶，AccuprimePfxDNAPolymerase高保真扩增酶购自于Invitrogen(上海)公司。pCDNA3.1(+)载体，DH5α感受态细胞，XhoI、EcoRI限制性内切酶，T4DNALigase购自于TaKaRa(大连)公司。通过重叠PCR将PCR-XL-TOPO和PIRES2-EGFP2个片段拼接为EcoRI-NR4A1-IRES-EGFP-XhoI的全长目的片段，并将其连接到pcDNA3.1构建重组质粒pcDNA3.1-Nur77-IRES-EGFP。经电泳和测序验证后，通过脂质体2000将重组质粒转染到培养的细胞中，采用RT-PCR和Westernblot检测转染效率。　　 1.3人类Nur77特异性siRNA(Nur77-siRNA)和对照siRNA合成自广州锐博生物公司。采用脂质体2000转染细胞(2×106/well)。转染后48小时采用实时定量PCR和Westernblot检测干扰效果。Westernblot分析结果表明，与对照组siRNA相比较，Nur77-siRNA抑制THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内Nur77蛋白表达效率为83％。　　 1.4根据Invitrogen公司RNA提取试剂盒操作说明提取培养细胞中提取总RNA。将1μg总RNA用逆转录试剂盒(TaKaRa)反转录成20μlcDNA。实时定量PCR在应用生物系统ABI7500FAST上进行。溶解曲线分析表明PCR反应产物为单独的双链DNA。用△△Ct值法，以GAPDH表达为内参定量其它基因的表达。　　 1.5流式细胞术检测细胞胆固醇吸收。THP-1细胞经PMA诱导分化成巨噬细胞后分别经Nur77激动剂CytosporoneB(Csn-B10μg/ml)，重组质粒过表达Nur77(Ad-Nur77)以及Nur77特异性siRNAs(si-Nur77)处理，然后加入荧光标记Dil-oxLDL培养细胞24小时。收集贴壁细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗三次后，采用BectonDickinson公司流式细胞仪分析细胞荧光强度。　　 1.6高效液相色谱检测细胞内胆固醇成分。THP-1细胞经PMA诱导分化成巨噬细胞再经ox-LDL诱导转化成泡沫细胞后，分别经Nur77激动剂CytosporoneB(Csn-B10μg/ml)），重组质粒过表达Nur77(Ad-Nur77)以及Nur77特异性siRNAs(si-Nur77)处理。待细胞处理结束后，弃培养基，PBS洗3遍，加入细胞裂解液200μl，反复冻融3次裂解细胞，BCA法定量蛋白后，7.2％三氯乙酸沉淀蛋白，800×g离心10min，取上清进行胆固醇检测，以豆甾醇为内标。取100μl上清液，加入8.9mol/L氢氧化钾溶液200μl，水解胆固醇酯后为细胞内总胆固醇检测样品。各样品分别与内标液混匀，用正己烷和无水乙醇抽提后，1.5mol/L的三氧化铬进行氧化衍生并真空干燥，100μl乙晴-异丙醇(80∶20)溶解样品，上样于高效液相色谱仪。采用WatersCorp公司2790高效液相色谱仪进行检测。　　 1.7采用液体闪烁技术检测细胞内胆固醇流出。THP-1细胞经PMA诱导分化成巨噬细胞再经ox-LDL诱导转化成泡沫细胞后，分别经Nur77激动剂CytosporoneB(Csn-B10μg/ml)，重组质粒过表达Nur77(Ad-Nur77)以及Nur77特异性siRNAs(si-Nur77)处理。待细胞处理结束后，弃培养基，PBS洗3遍，用0.2μCi/ml[3H]胆固醇在含有10％小牛血清RPMI-1640培养液共同孵育72小时。用PBS液洗涤细胞，置含脂蛋白的无血清RPMI-1640培养液中培养24小时。PBS液洗涤细胞，闪烁液裂解细胞后，用闪烁计数法检测培养液和细胞中的[3H]胆固醇。胆固醇流出率用培养液中CPM除以总CPM(培养液CPM+细胞CPM)，再乘以100％来表示。　　 2、Nur77对apoE-/-小鼠血浆脂质水平和血浆炎症因子表达水平影响的研究。　　 2.1血清IL-1β，IL-6和TNF-α浓度使用R&D公司商业ELISA试剂盒检测。血清CRP浓度使用CusabioBiotechCo公司商业ELISA试剂盒检测。　　 2.2血清载脂蛋白A1(apoA1)和载脂蛋白B100(apoB100)浓度采用Cusabio公司商业ELISA试剂盒进行测定。采用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(T-Cho)，总三酰甘油(TG)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)水平。　　 3、Nur77对apoE-/-小鼠肝脏脂质蓄积影响的研究。　　 3.1肝脏组织切片油红O染色。取肝组织样本在-30℃条件下滴加包埋剂进行包埋，用衡冷切片机进行切片。肝脏冰冻切片在60％异丙醇条件下固定10分钟，再采用含0.3％油红O染色液的60％异丙醇中孵育30分钟，随后采用60％的异丙醇洗净。采用苏木素复染后进行组织形态学定量分析。　　 3.2肝脏组织切片免疫组化。取肝组织样本在-30℃条件下滴加包埋剂进行包埋，用衡冷切片机进行切片。冰冻切片经多聚赖氨酸浸泡风干并以丙酮固定。采用Abcam公司兔抗Nur77一抗进行孵育，PBS洗后再采用酶标二抗孵育并显色。显色后采用奥林巴斯显微镜进行拍照分析。　　 4、Nur77对Caco-2细胞和apoE-/-小鼠肠脂质吸收相关基因表达影响的研究。　　 4.1Caco-2细胞生长于含有10％新生小牛血清的DMEM培养液中，37℃、5％CO2培养箱中静置培养。培养液中加100U/ml的青霉素和100μg/mL的链霉素。取对数生长期细胞进行实验。　　 4.2根据Invitrogen公司RNA提取试剂盒操作说明提取培养细胞和组织中总RNA。将1μg总RNA用逆转录试剂盒(TaKaRa)反转录成20μlcDNA。实时定量PCR在应用生物系统ABI7500FAST上进行。溶解曲线分析表明PCR反应产物为单独的双链DNA。用△△Ct值法，以GAPDH表达为内参定量其它基因的表达。　　 5、Nur77对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变影响的研究。　　 5.1从腹主动脉分叉至主动脉弓将主动脉剪下，干净剔除主动脉血管外的脂肪组织后，将主动脉树纵向剪开，主动脉树以用油红O染色观察整个主动脉的病变。　　 5.2自主动脉根部将心脏与主动脉分离，随即将心脏置于4％的多聚甲醛溶液中、常温下固定3h;冰冻切片时，将心脏自心尖剪去约1/3（沿与心脏纵轴垂直方向），以O.C.Tcompound包埋剂包埋。心尖朝下、将心脏垂直固定与冰冻切片机，自主动脉根部（或心底）向心尖方向进行低温冰冻连续10μm切片。每组随机取5个标本，每一个心脏标本，将连续12张10μm冰冻切片进行油红O染色，以IMAGEPROPLUS软件计算As病变面积。　　 结果：　　 1、Nur77对THP-1巨噬细胞胆固醇吸收，对THP-1巨噬细胞来源泡沫细胞脂质成分和胆固醇流出影响的研究。　　 我们首先检测THP-1细胞经PMA诱导分化成巨噬细胞后，分别经Nur77激动剂CytosporoneB(Csn-B10μg/ml)，重组质粒过表达Nur77(Ad-Nur77)以及Nur77特异性siRNAs(si-Nur77)处理后，细胞对胆固醇吸收的影响。THP-1巨噬细胞经Csn-B和Ad-Nur77处理后，巨噬细胞对荧光标记Dil-oxLDL吸收减少(P＜0.001)，而经si-Nur77处理后，巨噬细胞对荧光标记Dil-oxLDL吸收增加(P＜0.001)。接着我们采用高效液相色谱法和液体闪烁技术检测Nur77对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇成分和细胞胆固醇流出的影响。经Csn-B和Ad-Nur77处理后细胞内胆固醇成分减少(P＜0.05），而细胞内胆固醇流出增加（P＜0.05）。相反地，THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞经si-Nur77处理后，细胞内胆固醇成分增加（P＜0.05），而细胞胆固醇流出减少（P＜0.05）。　　 随后，我们采用实时定量PCR检测THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞分别经Csn-B、Ad-Nur77和si-Nur77处理后胆固醇代谢相关基因的表达。结果表明Nur77上调ATP结合盒体A1(ABCA1)，清道夫受体B类1型(SR-B1)的，C型尼曼-匹克蛋白(NPC1)，小凹蛋白1(CAV-1)和中性胆固醇酯水解酶(nCEH)基因表达水平(P＜0.05)。相反地，Nur77能下调的基因包括低密度脂蛋白受体(LDLR)，胆固醇酯转移蛋白(CETP)，清道夫受体CD36的SRA1(P＜0.05)。此外，Nur77对ATP结合盒G1(ABCG1)的mRNA的表达影响没有统计学意义（P＞0.05）。　　 接着我们观察THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞分别经Csn-B、Ad-Nur77和Si-Nur77处理后炎症基因表达情况。我们发现Nur77上调炎症基因包括转化生长因子(TGF-(β)和CD40(P＜0.05)，而Nur77下调基因包括白细胞介素-1β(IL-1β)，白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素12(IL-12)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，C-反应蛋白(CRP)，细胞间粘附分子1(ICAM-1)和核因子Kb(NF-κB)(P＜0.05)。此外，Csn-B对血管细胞粘附分子(VCAM-1)的mRNA表达影响没有统计学意义（P＞0.05），却能上调白细胞介素18(IL-18)mRNA的表达（P＜0.05）。Ad-Nur77能抑制VCAM-1的mRNA表达而si-Nur77能促进VCAM-1的mRNA表达（P＜0.05）。Ad-Nur77和si-Nur77对IL-18的mRNA表达影响没有统计学意义（P＞0.05）。此外，THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞分别经Csn-B、Ad-Nur77和si-Nur77处理后没有检测到γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素10(IL-10)的mRNA表达。　　 2、Nur77对apoE-/-小鼠血浆脂质水平和血浆炎症因子表达水平影响的研究。　　 接着我们检测Nur77激动剂(Csn-B)，Nur77慢病毒过表达载体(Ad-Nur77)和Nur77特异性siRNA慢病毒载体(si-Nur77)处理apoE-/-小鼠对后血浆脂质水平和血浆细胞因子水平的变化。我们发现apoE-/-小鼠经Csn-B和Ad-Nur77处理后，血浆高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)减少（P＜0.05）。而且，apoE-/-小鼠经Csn-B和Ad-Nur77处理后血浆低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)增加(P＜0.05)。相反地，apoE-/-小鼠经si-Nur77处理后，血浆中HDL-C明显增加（P＜0.05），而LDL-C水平却减少（P＜0.05）。然而，与对照组相比较，apoE-/-小鼠分别经Csn-B、Ad-Nur77和Si-Nur77处理后，血浆中载脂蛋白A1(apoA1)，载脂蛋白B(apoB)，极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)，总甘油三酯(TG)和总胆固醇(T-Cho)水平之间的差异没有统计学意义（P＞0.05）。　　 接着我们采用ELISA检测apoE-/-小鼠体内Nur77表达的变化是否会引起血浆炎性细胞因子的相应变化。我们发现，apoE-/-小鼠分别经Csn-B和Ad-Nur77处理后血浆CRP浓度减少(P＜0.05）。相反地，apoE-/-小鼠经si-Nur77处理后血浆CRP浓度增加(P＜0.05)。然而，在各对照组和处理组之间，血浆炎症因子IL-1β，IL-6和TNF-α水平之间的差异没有统计学意义（P＞0.05）。　　 3、Nur77对apoE-/-小鼠肝脏脂质蓄积影响的研究。　　 我们首先采用Westernblot和免疫组化检测分别经Csn-B、Ad-Nur77和si-RNA处理后apoE-/-小鼠肝脏Nur77蛋白表达情况。我们发现基础组Nur77蛋白质水平表达较低，而对照组Nur77蛋白表达增加。此外，与对照组相比较，Csn-B和Ad-Nur77处理组Nur77蛋白表达增加而si-RNA处理组Nur77表达减少。接下来，我们采用油红O染色和酶法分析Nur77对apoE-/-小鼠肝脏脂质含量的影响。与对照组相比较，Csn-B和Ad-Nur77处理组肝脏三酰甘油水平减少(P＜0.05），而si-Nur77处理组肝脏三酰甘油水平增加(P＜0.05)。然而，apoE-/-小鼠肝脏胆固醇水平在各组之间的差异没有统计学意义(P＞0.05)。　　 我们采用实时定量PCR检测肝脏组织中脂质代谢相关基因的表达以分析Nur77减少肝脏脂质蓄积的机制。与对照组相比较，Csn-B和Ad-Nur77处理组肝脏组织中LDLR，ATP结合盒G5(ABCG5)，CRP，固醇调节元件结合蛋白-1C(SREBP1C)和固醇调节元件结合蛋白-2(SREBP2)的mRNA表达较少(P＜0.05)，而SR-B1和肝脂酶(HL)的mRNA表达增加(P＜0.05)。此外，si-RNA处理组与对照组相比较，肝脏组织中LDLR，ABCG5，CRP，SREBP1c和SREBP2的mRNA表达增加(P＜0.05），而SR-B1和HL的mRNA表达减少(P＜0.05）。虽然Csn-B处理组肝脏组织中HMG-CoA还原酶(HMGCR)的基因表达减少(P＜0.05)，而Ad-Nur77处理组HMGCR的mRNA表达增加（P＜0.05），并且si-RNA处理组HMGCR的mRNA表达减少（P＜0.05）。此外，Nur77对apoE-/-小鼠肝脏组织apoA1和卵磷脂胆固醇转移酶(LCAT)的mRNA表达影响没有统计学意义(P＞0.05）。　　 4、Nur77对Caco-2细胞和apoE-/-小鼠肠脂质吸收相关基因表达影响的研究。　　 为了研究Nur77对肠脂质吸收的影响，我们通过培养Caco-2细胞，分别经Nur77激动剂(Csn-B10μg/ml)，重组质粒过表达Nur77(Ad-Nur77)以及Nur77特异性siRNAs(si-Nur77)处理后，检测肠脂质转运相关基因表达水平。我们发现，与对照组相比较，Csn-B和Ad-Nur77处理后Caco-2细胞内微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)，尼曼-匹克C1型类似蛋白1(NPC1L1)和ABCG5基因表达水平减少（P＜0.05）。相反，经si-Nur77处理后Caco-2细胞内MTP，NPC1L1和ABCG5基因表达水平增加(P＜0.05）。同样，我们也检测了apoE-/-小鼠分别经Csn-B、Ad-Nur77和si-RNA处理后肠组织中MTP，NPC1L1和ABCG5表达情况。我们发现MTP，NPC1L1和ABCG5基因表达水平变化与Csn-B、Ad-Nur77和si-RNA处理Caco-2细胞后基因表达水平变化一致。　　 5、Nur77对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变影响的研究。　　 我们通过观察apoE-/-小鼠主动脉窦和整个主动脉树的动脉粥样硬化病变面积大小评估Nur77对动脉粥样硬化病变的影响。我们发现apoE-/-小鼠经Csn-B和Ad-Nur77处理后，主动脉窦和整个主动脉树动脉粥样硬化病变面积都减少(P＜0.05)，相反地，apoE-/-小鼠经si-Nur77处理后，主动脉窦和整个主动脉树动脉粥样硬化病变面积都增加(P＜0.05）。　　 接下来，我们采用实时定量PCR检测主动脉组织炎症分子，粘附分子以及与胆固醇代谢相关基因表达的情况。与对照组相比较，apoE-/-小鼠分别经Csn-B和Ad-Nur77处理后，主动脉组织中SRA1，CD36，IL-1β，IL-6，CRP，ICAM-1，巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因表达减少(P＜0.05)，但ABCA1，SR-B1，NPC1和CD40分子基因表达增加（P＜0.05）。相反地，与对照组相比较，apoE-/-小鼠经si-Nur77处理后，主动脉组织中SRA1，CD36，IL-1β，IL-6，CRP，ICAM-1，MIP-1α和MCP-1基因表达增加(P＜0.05），而ABCA1，SRB1，NPC1和CD40基因表达减少（P＜0.05）。另外，TNF-α基因表达水平在Ad-Nμr77处理apoE-/-小鼠主动脉组织中减少(P＜0.05)，而在si-Nur77处理apoE-/-小鼠主动脉组织中增加(P＜0.05）。但是Csn-B处理apoE-/-小鼠主动脉组织中TNF-α基因表达变化没有统计学意义(P＞0.05)。　　 结论：　　 1、Nur77能减少THP-1巨噬细胞胆固醇吸收，减少THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内脂质成分并增强THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇流出。2、Nur77能减少apoE-/-小鼠血浆HDL胆固醇水平，增加LDL胆固醇水平并减少血浆CRP水平。3、Nur77能减少apoE-/-小鼠肝脏三酰甘油水平但不影响肝脏胆固醇水平。4、Nur77能减少肠脂质吸收相关基因的表达。5、Nur77能减少apoE-/-小鼠主动脉动脉粥样硬化病变面积。