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椎间盘退变影响因素众多，而其细胞外基质的改变，尤其是Ⅱ型胶原的减少和Ⅰ型胶原的增加被认为是椎间盘退变的显著特点之一。我们前期的研究发现microRNA在椎间盘退变的机制中发挥着重要的作用，针对退变椎间盘组织的microRNA芯片检测提示miR-129-5p在退变椎间盘髓核组织中出现异常下调。生物信息学方法预测COL1A1mRNA（Ⅰ型胶原基因）和ITGA1mRNA（整合素α1基因）为miR-129-5p的潜在靶基因。椎间盘退变时髓核中Ⅰ型胶原增多的分子机制尚不明确，而整合素α1又是Ⅰ型胶原于髓核细胞上的受体。miR-129-5p作为同时调控配体（Ⅰ型胶原）和受体（整合素α1）的关键分子，在椎间盘退变进程中势必发挥着重要的作用。本研究在明确了miR-129-5p、COL1A1及ITGA1在退变及正常椎间盘髓核组织内的表达分布差异后，分别通过体外实验验证miR-129-5p对COL1A1及ITGA1的直接调控作用，通过体内调控miR-129-5p观察其对退变模型病理进程的影响；并且进一步验证了miR-129-5p可能的上游表观遗传学调控机制。本研究以miR-129-5p作为中心环节，构筑了相对完整的椎间盘退变miR-129-5p调控机制，在椎间盘退变领域提出了全新的退变机制学说，并详细阐明了其上下游调控机制。整个研究分为以下四个实验：实验一人体髓核组织中miR-129-5p及COL1A1、ITGA1表达量的研究背景及目的：我们前期microRNA芯片检测提示miR-129-5p在退变椎间盘髓核组织中出现异常下调。生物信息学方法预测COL1A1mRNA（Ⅰ型胶原基因）和ITGA1mRNA（整合素α1基因）为miR-129-5p的潜在靶基因，Ⅰ型胶原的增加被认为是椎间盘退变的显著特点之一，而整合素α1作为Ⅰ型胶原于髓核细胞上的受体，其在椎间盘退变进程中的作用尚无报道。要想探明上述三者在椎间盘退变进程中的作用，本部分实验首先探索了miR-129-5p、COL1A1及ITGA1mRNA及其编码的蛋白在退变及正常椎间盘髓核组织的表达分布差异。方法：收集正常尸体及退变患者的椎间盘髓核组织，用实时定量PCR方法检测其miR-129-5p、COL1A1及ITGA1mRNA的表达丰度差异，用天狼猩红染色方法观察其胶原的分布差异，用HE染色方法观察其病理学差异，用免疫荧光染色方法和westen blot方法观察其Ⅰ型胶原及整合素α1表达和分布的差异，用荧光原位杂交-荧光免疫组化双标方法观察其miR-129-5p与Ⅰ型胶原及整合素α1的共表达情况。结果：天狼猩红染色结果提示退变髓核组织Ⅱ型胶原被Ⅰ型胶原取代，椎间盘髓核组织中miR-129-5p下调，同时ITGA1和COL1A1mRNA及其编码的蛋白均出现上调，荧光原位杂交-荧光免疫组化双标结果提示miR-129-5p阳性细胞Ⅰ型胶原及整合素α1表达阴性，反之亦然。结论：在髓核组织中，miR-129-5p的表达与ITGA1和COL1A1mRNA及其编码的蛋白表达呈现负向调控趋势。实验二miR-129-5p对COL1A1、ITGA1表达调控的体外研究背景及目的：通过实验一我们发现了在髓核组织中，miR-129-5p的表达与ITGA1和COL1A1mRNA及其编码的蛋白表达呈现负向调控趋势，然而在退变髓核组织中miR-129-5p和COL1A1及ITGA1的表达差异是由于两者间的直接作用导致还是通过某些特定的中间信号通路导致呢？生物信息学方法预测，COL1A1及ITGA1mRNA的3’UTR存在与miR-129-5p的潜在结合位点，这为我们研究miR-129-5p直接调控COL1A1及ITGA1mRNA提供了理论依据。本部分实验旨在探索miR-129-5p对COL1A1及ITGA1mRNA的直接调控作用，及其对细胞生物学功能的影响。方法：通过双荧光素酶报告基因方法检测miR-129-5p对ITGA1和COL1A1mRNA3’UTR的直接作用，用慢病毒转染原代培养的髓核细胞，上调/下调其miR-129-5p的表达，用western blot方法检测对COL1A1及ITGA1的表达影响；用实时定量PCR方法确认骨肉瘤细胞系MG-63及U-2OS中有miR-129-5p的表达后，用慢病毒转染MG-63及U-2OS，上调/下调其miR-129-5p的表达用细胞划痕实验及Trans-well实验检测其对细胞功能学的影响。结果：ITGA1和COL1A1mRNA3’UTR是miR-129-5p的直接作用靶点，上调/下调miR-129-5p的表达后，原代培养的髓核细胞中COL1A1及ITGA1的表达呈现出相应的下调/上调改变。细胞划痕实验提示上调miR-129-5p表达组U-2OS及MG-63细胞划痕愈合速度明显快于下调组。Trans-well实验提示上调miR-129-5p表达组U-2OS及MG-63细胞迁移和侵袭能力明显上升；下调miR-129-5p表达组U-2OS及MG-63细胞迁移和侵袭能力明显下降。结论：miR-129-5p通过与其靶基因ITGA1和COL1A1mRNA3’UTR的直接作用，影响靶蛋白Collagen Ⅰ和Integrinα1的表达，从而引起细胞功能学的改变。实验三miR-129-5p对COL1A1、ITGA1表达调控的体内研究背景及目的：通过实验一及实验二我们确证了miR-129-5p对其靶基因ITGA1和COL1A1mRNA3’UTR的直接作用，然而体外培养的细胞成分简单，条件可控性好，影响因素单一，与活体条件下椎间盘组织的细胞微环境相差甚远。本部分实验旨在利用C57小鼠椎间盘退变模型，观察体内调控miR-129-5p对椎间盘退变病理进程的影响。方法：用实时定量PCR方法确认C57小鼠体内miR-129-5p的表达丰度后，用鼠尾穿刺法造成C57小鼠椎间盘退变模型，分别于造模后通过腺相关病毒转染，上调或下调miR-129-5p在椎间盘的表达，通过western blot检测转染后3、6、12w个时间点小鼠椎间盘Collagen Ⅰ及Integrinα1的表达变化，通过椎间隙高度指数，组织学评分，荧光原位杂交-荧光免疫组化双标方法观察各时间节点对小鼠椎间盘退变程度的差异。结果：造模后3、6、12周，Collagen Ⅰ及Integrinα1的表达随着时间持续上升，上调/下调miR-129-5p可以降低/增加各时间节点Collagen Ⅰ及Integrinα1的表达；上调miR-129-5p可以时间节点椎间隙高度指数及组织学评分明显优于下调miR-129-5p组及阳性对照组。结论：miR-129-5p在体内试验中表现出对椎间盘退变的保护作用，下调miR-129-5p可以使椎间盘退变程度增加。实验四miR-129-5p表观遗传学调控机制的研究背景及目的：实验一到实验三通过了体外及体内验证，阐明了miR-129-5p对其下游靶基因靶蛋白的调控机制。然而其上游的调控机制尚不明确。本部分实验旨在探索miR-129-5p上游的调控机制。方法：取正常对照组及退变组髓核组织各5例，针对miR-129-5p前体miR-129-1及miR-129-2启动子10kb范围内存在的4个CpG岛行甲基化DNA免疫共沉淀-实时定量PCR（MeDIP-PCR）检测，在体外培养的原代髓核细胞中，用DNA甲基化抑制剂5-Aza-2’-deoxycytidine (5Aza-CdR)处理后通过qRT-PCR检测其对miR-129-5p及其下游靶基因ITGA1和COL1A1mRNA的表达调控作用。结果：定位于miR-129-2chr11:43596990-43597336及chr11:43602545-43603215的的两个CpG位点DNA甲基化程度在退变椎间盘中明显上调（P<0.05），体外培养的原代髓核细胞经过5Aza-CdR处理后miR-129-5p表达上调，ITGA1和COL1A1mRNA表达下调。结论：miR-129-5p在椎间盘退变进程中的异常下调与其前体pre-miR-129-2定位于chr11:43596990-43597336及chr11:43602545-43603215的两个CpG岛发生了异常的甲基化密切相关。