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肝癌是当今人类面临的一种病死率极高的肿瘤,全球每年因肝肿瘤死亡的人数逐年攀升,我国是肝癌高发的主要国家,因此寻找一种治疗和预防肝癌的有效手段迫在眉睫。手术、放疗、化疗是目前治疗肝癌的主要手段,但其复发转移及耐药性是肝癌目前治疗面临的主要关键问题,而肝癌肿瘤干细胞(Liver canoer stem cells LCSCs)则是主要原因,因此靶向肝癌肿瘤干细胞成为近年治疗肝癌的新的突破点。扶正化瘀解毒方是我们在临床经验的基础上筛选的治疗肝癌的有效中药复方,但其对肝癌干细胞的作用及其机制并不清楚,本课题在前期研究的基础上,探讨扶正化瘀解毒方有效成分桦木酸抗肝癌干细胞的作用及其机制。第一部分含黄芪与人参扶正化瘀解毒方体内抗肿瘤作用的比较为比较含黄芪与人参扶正化瘀解毒方抗肿瘤作用之间的差异,选择I CR小鼠,建立H22肝癌荷瘤小鼠模型,设立模型对照组、环磷酰胺组和含黄芪扶正化瘀解毒方组,含人参扶正化瘀解毒方组。接种H22肝癌细胞后,模型对照组每天灌胃蒸馏水,环磷酰胺组腹腔注射,实验组分别灌胃组方药,连续10天。每天测量肿瘤大小,实验结束后,处死小鼠,剥离肿瘤,取脾脏、胸腺,称重,计算抑瘤率、脾脏指数及胸腺指数。实验结果显示,与模型对照组比较,两种组方均能明显抑制H22肝癌荷瘤小鼠的肿瘤质量,但两种组方之间的抑瘤作用没有显著性差异,含黄芪复方的抑瘤率比以含人参复方的抑瘤率稍大,抑瘤率达42.70%;两种组方对脾脏指数和胸腺指数亦没有明显影响。实验结果提示,含黄芪的扶正化瘀解毒方的抗肝癌的作用较佳。第二部分扶正化瘀解毒方有效成分体外抗肿瘤作用比较为比较扶正化瘀解毒方有效成分体外抗肿瘤作用的差异,应用人肝癌HepG2细胞、人肝癌Huh7细胞、人肺癌A549细胞,采用CCK8法对扶正化瘀方的各组成药物的化学成分特女贞苷、姜黄素、熊果酸、齐墩果酸、S1、S2、S3、桦木酸、山楂酸、科罗索酸等进行体外抗肿瘤作用研究。实验结果显示：特女贞苷对人肝癌HepG2细胞没有增殖抑制的作用；姜黄素、熊果酸、齐墩果酸、S1、S2、S3、桦木酸、山楂酸、科罗索酸等对人肝癌HepG2细胞、人肝癌Huh7细胞、人肺癌A549细胞的增殖活性均有一定的抑制作用。其中山楂酸的IC50分别为37.3μmol·L-1、70.2μmol·L-1和136.64μmol·L-1,桦木酸的IC50分别为11.2μmol·L-1、34.67μmol·L-1和75.29μmol·L-1,科罗索酸的IC50分别为15.1uμmol·L-1、27.79μmol·L-1和106.53μmol·L-1。上述结果表明,扶正化瘀解毒方的有效成分桦木酸、山楂酸、科罗索酸具有较好的抗肿瘤作用。第三部分扶正化瘀解毒方有效成分桦木酸对肝癌细胞Wnnt通路的影响为研究桦木酸抗肿瘤作用的机制,体外培养人肝癌HepG2细胞株,桦木酸作用48h, CCK8法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞增殖周期及凋亡的变化,蛋白免疫印迹法检测Wnt通路的β-catenin、GSK-3β、pGSK-3β、CyclinD1、C-Myc蛋白的表达。实验结果显示,40μmol·L-1桦木酸作用后,HepG2细胞G1/G0期(P<0.01)及G2/M期(P<0.05)细胞明显减少,S期(P<0.01)细胞明显增加；10、20、40μmol·L-1桦木酸细胞凋亡率也均有显著性升高(P<0.01),并呈明显的剂量依赖性；β-catenin(P<0.01)、pGSK-3β(P<0.01). CydinD1(P<0.05)、C-Myc(P<0.01)蛋白表达明显下降。结果表明,桦木酸可能通过抑制Wnt通路激活发挥抗肿瘤作用。第四部分扶正化瘀解毒方有效成分桦木酸对肝癌干细胞样细胞的作用为研究桦木酸对肝癌干细胞的作用,通过无血清培养法,成功富集HepG2细胞肝癌肿瘤球干细胞(sphere forming cells,SFCs)；桦木酸作用48h,通过克隆形成实验观察肝癌SFCS的自我更新能力,流式细胞仪检测肝癌SFCs干细胞标记分子,CCK8法检测LCSCs的增殖活力,流式细胞仪检测细胞增殖周期及凋亡的变化。实验结果显示,桦木酸作用于LCSCs后,对人肝癌HepG2肿瘤干细胞球有抑制作用,作用48h后抑制效果最好。G1/G0期(P<0.05)及G2/M期(P<0.05)细胞明显减少,LCSCs的凋亡率增大,呈现一定的剂量-效应关系。上述结果显示,桦木酸对人肝癌HepG2细胞干细胞具有一定的抑制作用。本课题研究表明,扶正化瘀解毒方的组成药物石见穿的化学成分桦木酸对人肝癌HepG2细胞及其肿瘤干细胞具有一定的增殖抑制作用,该抑制作用与Wnt通路的抑制作用相关。