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肺癌是导致死亡的主要原因之一，每年有近140万人死于肺癌。大多数病人被确诊时已属晚期，这是本病高死亡率的主要原因。肺癌的基因靶向治疗是近年新兴的一种治疗手段，具有高度选择性地杀死肿瘤细胞而不杀伤或仅很少损伤正常细胞的特点。然而，恰恰由于靶向治疗是为攻击特异性靶分子而设计，所以须找到合适靶点才能发挥其疗效。Decorin是一种主要存在于结缔组织中与胶原纤维相关的蛋白多糖，调节和控制组织形态发生、细胞分化、运动、增殖及胶原纤维形成等过程，对防止组织和器官纤维化的发生有重要意义。近年来随着decorin研究深入，发现其在多种恶性肿瘤呈现异常表达，特别是decorin可以和多种生长因子结合，负性调节肿瘤细胞生长，使之在肿瘤的发生及治疗中受到越来越多的关注。人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂（human secretory leukoprotease inhibitor,hSLPI）是由呼吸道及生殖道粘膜上皮分泌的蛋白质，在非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)中高表达，在正常组织尤其是肝中表达极低，具有肿瘤细胞特异性， hSLPI作为基因启动子具有相对更好的特异性属于肿瘤特异性启动子，可以调控decorin基因在肺癌细胞内特异性表达，靶向杀伤肺癌细胞而不影响正常肺组织细胞。本实验探讨通过构建由hSLPI启动子调控的decorin基因真核表达载体，在肺癌细胞中特异性表达并靶向抑制该细胞，以达到基因治疗靶向性的目的，从而提高肺癌基因治疗的安全性与有效性。研究取得了如下进展：1、应用基因工程重组技术成功构建了hSLPI启动子调控decorin真核表达载体通过PCR技术从外周血基因组克隆出1250bp的hSLPI启动子序列全长，经DNA测序分析表明，该启动子序列与Genebank中hSLPI基因上游的5′末端转录调控区的序列完全一致；将hSLPI启动子序列及decorin分别定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，经限制性内切酶鉴定及分子测序证实了hSLPI及decorin的插入位置正确，DNA序列与GeneBank数据库完全吻合，从而成功构建了pcDNA3.1-hSLPI-decorin真核表达载体，为实施hSLPI调控下的decorin靶向特异性抑制肺癌细胞奠定了实验基础。2、成功实现了hSLPI启动子调控的decorin基因靶向特异性肺癌细胞的表达应用脂质体介导的pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1-decorin、pcDNA3.1-hSLPI-decorin分别稳定转染肺癌A549细胞株及肝癌HepG2细胞，RT-PCR、免疫组织化学、Westem blot及ELISA法的结果均证实：hSLPI启动子调控decorin基因只在肺癌A549细胞内表达，而在肝癌HepG2细胞内不表达，证实了本研究所构建的先进载体特异性地使decorin表达于肺癌细胞，实现了治疗基因靶向特异性表达功能，从分子载体设计层面为屏蔽导入基因普遍整合宿主细胞而引起的毒副作用提供分子结构基础。3、证实了decorin基因靶向特异性抑制肺癌细胞的生物学功能对真核表达载体pcDNA3.1-hSLPI-decorin靶向抑制肺癌细胞体外研究的结果表明，经脂质体介导的pcDNA3.1-hSLPI-decorin转染肺癌A549细胞后，从第四天起，肺癌A549细胞生长缓慢，细胞生长率明显下降，细胞生长受到明显抑制，与相同载体转染的HepG2细胞组，空质粒转染组相比具有明显的统计学差异，提示所构建的pcDNA3.1-hSLPI-decorin真核表达载体具有较强的表达效率及肺癌靶向抑制功能，为实现肺癌基因靶向治疗提供了实验依据。对真核表达载体pcDNA3.1-hSLPI-decorin抑制肺癌细胞生长的细胞周期分析，表明pcDNA3.1-hSLPI-decorin转染A549的细胞株，G1期向S期转变明显受到抑制，G1期细胞百分率较转染HepG2及空质粒细胞组明显增高，提示真核表达载体pcDNA3.1-hSLPI-decorin抑制肺癌生长作用可通过诱导细胞周期G1期停滞来抑制肺癌细胞的生长。4、真核表达载体pcDNA3.1-hSLPI-decorin转染与铂类化疗药物联用明显提高了肺癌细胞的杀伤效率不同浓度的化疗药物顺铂，卡铂分别作用于真核表达载体pcDNA3.1-hSLPI-decorin、pcDNA3.1(+)转染的肺癌A549细胞与无基因转染的A549细胞。MTT法检测结果表明卡铂、顺铂作用于真核表达载体pcDNA3.1-hSLPI-decorin转染的肺癌A549细胞的IC50明显降低了近3倍。荧光实时定量PCR技术检测各组A549细胞的Bcl-2及ERCC-1mRNA的表达情况，结果表明在pcDNA3.1-hSLPI-decorin基因转染的A549细胞组ERCC-1、Bcl-2mRNA表达水平明显降低，表明这可能是decorin基因可通过抑制ERCC-1、Bcl-2基因表达，从而表达提高对铂类药物A549细胞杀伤效率的机制。本研究通过成功的构建靶向肺癌细胞真核表达载体实现了decorin基因的在肺癌细胞的特异性表达及特异性抑制肺癌细胞的生长，该真核表达载体转染A549细胞后增强了铂类化疗药物对肺癌细胞的杀伤效率，这些结果充分说明经过分子优化层层组装的靶向表达载体pcDNA3.1-hSLPI-decorin能够特异地抑制肺癌细胞生长，为最终靶向载体治疗肺癌提供了实验基础。