论文部分内容阅读
目的本研究旨在建立共表达Cas9和SV40 LT的血管内皮细胞系,方便内皮细胞的大量培养,后续利用CRISPR系统切除SV40 LT或任何基因,用于心血管疾病及癌症等分子机制研究。方法首先构建共表达Cas9和SV40 LT的永生化人脐静脉内皮细胞系。两条技术路线:两步法是先后分别转染表达SV40 LT和Cas9的慢病毒载体,得到HUVEC2-CTG;一步法是利用overlap PCR和同源重组法构建慢病毒载体Lv-EF1 α-Cas9-IR ES-SV40 LT,然后感染原代HUVEC2,得到HUVEC2-CT。随后设计并筛选针对S V40 LT 的 CRISPR 系统,转染 HUVEC2-CTG 细胞,得到 HUVEC2-C△TG。用 We stern Blotting在蛋白水平验证Cas9对SV40 LT的切除效果。用CCK8法检测HU VEC2-CΔTG细胞体外增殖情况,免疫细胞化学检测CD31、CD34,vWF,并研究SV40 LT切除前后内皮细胞Matrigel管型形成功能,用转录组测序比较SV40 LT切除前后内皮细胞的转录组差异。在GEO数据库上挖掘出CAVD相关的基因和m iRNA数据,利用生物信息学方法来甄别差异性基因和miRNA。对具有差异性表达特征的的基因组网络进行了生物学反应过程与分子通路的聚类分析,并且研究和分析了 miRNA-基因调控网络,寻找利用建立的血管内皮细胞进行深入机制研究的切入点。结果我们分离培养出了原代人脐静脉血管内皮细胞,命名为PUMC-HUVEC2,其形态表现为典型的鹅卵石样。在感染SV40 LT-GFP后,利用PCR/Western Blottin g分别检测到在DNA/蛋白两个层次上SV40 LT的表达,命名为HUVEC2-TG,呈内皮形态、结合凝集素。进一步转染Cas9,获得稳定表达的HUVEC2-CTG,West ern Blotting显示在挑取的25个单克隆细胞株中23个有Cas9表达,基因组DNA检测也显示Cas9阳性。HUVEC2-CTG为内皮形态、结合凝集素。构建的慢病毒载体Lv-EF1α-Cas9-IRES-SV40 LT测序正确后,一步转染获得了 Cas9和SV40 LT共同稳定表达的HUVEC2-CT,在基因组DNA中检测到了Cas9和SV40 LT的表达。构建的针对SV40 LT的CRISPR系统,转染至HUVEC2-CTG细胞中,得到了HUVEC2-C△TG。用CCK8法检测HUVEC2-C△TG细胞体外增殖情况,结果证明敲除后的细胞生长速度显著低于对照组细胞,其中HUVEC2-C△TG-27切除前3、5、7天的OD值分部是（0.45±0.017）、（0.64±0.067）和（0.93±0.110）,切除后3天（0.24±0.005）、5天（0.30±0.011）、7天（0.27±0.011）明显降低（P 值均小于0.001）,表明HUVEC2-C△TG细胞的体外增殖能力下降。根据CCK8检测HUVEC2-C△TG细胞的增殖情况的结果,选择SV40 LT切除效果最好的HUVEC2-C△TG-27,免疫细胞化学验证HUVEC2-TG/HUVEC2-CTG-27/HUVEC2-C△TG-27细胞的内皮细胞特性,结果显示CD31、CD34以及vWF均表达为阳性,并未见明显差异。HUVEC2-TG/HUVEC2-CTG-8、22、27/HUVEC2-C△TG-8、22、27 内皮细胞 Matrigel管型形成功能结果显示,这些内皮细胞在Matrigel上均可以形成典型的管样结构,未发现明显差异。根据转录组表达谱全面分析的结果来看,HUVEC2-CTG-8、22、27在SV40 LT切除前细胞增殖相关基因就存在差异表达,与其SV40 LT和Cas9在基因组中插入的位置不同有关。随后分析了切除SV40 LT后发生显著差异表达的基因,发现分别有246、141、506个基因发生差异表达。我们进一步对差异基因进行分子通路聚类分析,从中发现三个细胞株中免疫反应相关通路都上调,而下调通路并不一致,其中细胞HUVEC2-CΔTG-8下调基因主要集中在细胞骨架重塑、细胞趋附与细胞周期相关通路,细胞HUVEC2-CΔTG-22下调基因主要集中在纤维化形成相关通路,细胞HUVEC2-C△TG-27下调基因主要集中在代谢相关通路。我们重点关注了与细胞增殖相关的基因变化,发现SV40LT切除后的差异基因中部分细胞增殖相关基因在不同细胞株中发生相同的变化。我们进一步分析了这些细胞增殖相关的差异基因的分子通路,发现在三个细胞株中,增殖相关的差异基因均能聚类到胰岛素样生长因子（IGF）相关通路,其中主要是IGF结合蛋白（IBP）4-7发生变化。通过对CAVD患者的差异基因进行生物信息学分析,发现CAVD患者的上调基因主要聚类到对外界刺激的反应、生物大分子代谢、免疫细胞激活上,而下调基因则集中在对外界刺激的反应、心肌细胞发育、离子稳态上。另外,多种CAVD病因的相关基因均有部分差异表达。同时,1 10个miRNA表达发生显著差异。在下调miRNA-上调基因模式中,找到了可调控HLA-DRB1和HLA-DRB5的3个miRNA以及5个可调控VCAM1的miRNA。上调miRNA-下调基因中,HAND2与hsa-miR-6081、ACTC1与hsa-miR-4793-5p存在相互作用。为下一步利用所建细胞系进行深入研究奠定了基础。结论本研究分别用两步法及一步法建立了共表达Cas9和SV40LT的内皮细胞系H UVEC2-CTG和HUVEC2-CT;已利用CRISPR系统切除永生化基因SV40 LT,证明切除后增殖下降,发生了基因表达谱改变,是优化的血管内皮细胞模型。生物信息学分析找到的CAVD疾病发生潜在的分子机制,待下一步利用所建内皮细胞模型等验证。