大肠癌肝转移是导致大肠癌病人死亡的主要原因。有效的切断转移途径，成为临床除手术切除原发肿瘤外，能提高患者生存率，延长无瘤生存期，彻底根治大肠癌的关键问题。肿瘤细胞增殖、粘附、侵袭和转移机制是多基因、多步骤、多阶段相互作用的级联反应结果。虽然人们在这一领域进行了大量的研究工作，但目前转移机制仍不明确，也无有效的治疗方法。早在70年代末，人们就发现肿瘤转移可能与一类肝素样物质的作用有关，并对肝素在肿瘤转移中的作用进行深入研究。80年代初期，乙酰肝素和乙酰肝素酶的发现，为肿瘤转移研究开辟了新的领域。乙酰肝素(Heparan Sulfate Proteoglycans，HSPGs)，又称硫酸乙酰肝素多聚糖，是一种蛋白聚糖类碳水化合物，为广泛存在于有脊椎动物和无脊椎动物组织细胞外基质(extracelluler matrices ECM)和细胞表面的生物大分子，是基底膜的主要构成成分。它能与细胞表面及ECM中的活性分子结合，粘附于细胞表面，是ECM聚集和稳定的基础。乙酰肝素酶(Heparan sulfate，Heparanase，HP)是一种葡萄糖醛酸酯酶，可切断细胞外基质中结合在乙酰肝素蛋白聚糖上的侧链，使其网络状结构遭到降解，破坏基质正常的稳定结构，使肿瘤组织易于扩散和转移。因此，乙酰肝素酶目前被认为是一种与肿瘤细胞生长和转移密切相第一军医大学博士研究生学位论文关的、广泛存在于细胞外基质中的物质。本研究拟采用免疫组化、原位杂交、基因转染、细胞培养、动物模型等技术方法，对乙酞肝素酶在大肠癌肝转移中的作用机制及其竞争性结合剂抑制肿瘤转移的作用深入研究。研究内容:1.观察乙酞肝素酶mRNA、层粘连蛋白及其受体在大肠腺瘤、大肠腺癌、大肠癌转移淋巴结及大肠癌肝转移中的表达，试图证明乙酸肝素酶、基膜蛋白与大肠癌转移的相关性。2.通过对低转移能力的大肠癌HT29细胞系进行乙酞肝素酶基因转染，对转化细胞生长、侵袭能力进行多方面检测，进一步探讨一该酶对大肠癌细胞转移能力的影响。3.建立基因转化细胞移植瘤回盲部原位种植致肝转移的动物实验模型，分析该酶对动物肝转移率的影响;以证明乙酞肝素酶在大肠癌生成及转移中所具有的重要作用。4.检测不同转移能力的大肠癌细胞中乙酞肝素酶mRNA表达状况，探讨该酶对癌细胞转移能力的影响。5.利用乙酞肝素酶抑制剂昆布多糖(或称海带多糖)降低乙酞肝素酶含量或酶活性的作用，减少对乙酞肝素的降解，维护细胞外基质的稳定，达到防治肿瘤增生和转移的目的，为抗大肠癌肝转移的药物开发提供理论依据。6.通过对乙酞肝素酶反义寡核营酸抑制大肠癌细胞株体外增殖活性的研究，在分子水平明确该酶对细胞生物活性的影响。主要方法及结果: 1.乙酞肝素酶反义寡核普酸探针合成及标记后，采用原位杂交及免疫组化的方法，检测乙酞肝素酶mRNA、层粘连蛋白(LN)及其受体(LR)在大肠腺瘤、大肠腺癌、大肠癌转移淋巴结及大肠癌肝转移中的表达。结果发现:乙酞肝素酶mRNA在大肠癌病灶及淋巴结癌转移中均有表第一军医大学博士研究生学位论文达，两者之间有显著差异;在良性肿瘤几乎不表达，表达差异非常显著;LN在大肠癌组织及淋巴结转移灶中的表达减弱，而LR则明显增强。乙酞肝素酶mRNA与层粘连蛋白的表达呈负相关，与层粘连蛋白受体的表达呈正相关。阳性区域主要定位于癌巢组织周围的间质细胞胞浆中，而原发灶中少量的癌细胞也有表达，转移灶中癌细胞表达较原发灶增多。 2.将人乙酞肝素酶cDNA序列，以脂质体介导的方法转入低转移能力的大肠癌细胞系HT29中，通过对转化细胞增殖能力、软琼脂克隆形成率、同质和异质粘附率以及细胞体外侵袭能力的观察。结果显示:基因稳定转染后，高表达乙酞肝素酶基因的细胞生长速度明显加快，体外侵袭能力明显增强。 3.建立乙酞肝素酶基因转化细胞裸鼠皮下种植，并将移植瘤于裸鼠回盲部原位种植致肿瘤肝转移的动物实验模型，观察模型动物肝转移率;分析肿瘤大体、光镜及肿瘤血管生成变化。结果表明:转化细胞形成实体瘤较大，瘤体血管反应明显，数量丰富;细胞异型性增多，肝转移率提高。结果表明:乙酞肝素酶具有增强大肠癌HT29细胞系发生肝转移率和促进肿瘤血管的生成的能力。 4.分析不同转移能力的大肠癌HT29细胞系和LoVO细胞系中乙酸肝素酶的表达。研究发现:不同转移能力的大肠癌细胞系，乙酞肝素酶mRNA的表达有所差异，高转移的LOVo细胞表达较高，而低转移HT29细胞的表达较低。 5.应用同质、异质粘附实验，细胞分离及侵袭小室等实验技术检测不同浓度昆布多糖对四种大肠癌细胞系生物学特性的影响。结果显示:在低浓度药物作用时，与基质粘附能力和同质粘附性，以及细胞分离能力均无明显变化，高浓度药物作用后，与基质和同质粘附性均下降;细胞穿过基底膜能力减弱。6.采用乙酞肝素酶反义寡核昔酸抑制大肠癌细胞株体外增殖活性的研究。结果显示:乙酞肝素酶反义寡核昔酸可以抑制人大肠癌HT29细胞乙酞肝素酶mRNA的表达，这种抑制作用与特异序列及剂量有依赖