癌症是威胁人类生命恶性疾病之一，全世界因患癌症死亡的人数每年在500万以上，中国每年新发现癌症患者有160多万，死亡130多万。其中白血病是一类临床常见的造血系统恶性肿瘤，俗称“血癌”，占癌症总发病数的5％，在我国各年龄组肿瘤死亡率中，白血病居第6位（男性）和第8位（女性），在儿童及35岁以下成人中则占第1位。中国以草药治病的历史悠久，药用植物品种多，从这些植物中开发抗癌新药的前景十分看好。三尖杉酯碱、喜树碱（生物碱）、紫杉醇和β-榄香烯（萜类）等就是成功的例子。因为迄今为止，也只有从天然产物中，才能找到如此结构新颖和作用独特的化合物。从植物中探索抗癌新药，已是科学家们热衷的研究方向。尤其白血病治疗方面，常规化疗药阿霉素等给病人所带来的痛苦已家喻户晓，而骨髓移植费用昂贵，一般家庭无法承担。因此，很有必要从天然中草药有效成分中寻找高效、低毒的抗白血病药物。β-七叶皂苷（Beta-escin，aescin）是从七叶树科中国天师栗（Aesculuswilsonii Rebd）、欧洲七叶树（Aesculus hippocastannum／Horse chestnut）、日本七叶树（Aesculus turbinata Blume）和浙江七叶树（Aesculus Chinensis var.chekiangensis Fang）干燥成熟果实娑罗子（Semen Aesculi）中提取的天然三萜糖苷类化合物，具有抗炎症渗出、增加静脉张力、改善微循环促进肢体功能恢复等作用。β-七叶皂苷目前临床主要用于脑水肿、脑梗死、颅脑外伤及肢体肿胀等疾病的治疗。近年来，有关β-七叶皂苷抗肿瘤活性已有所报道：邹明、郭维等研究发现七叶皂苷具有抑制人鼻咽癌细胞KB、小鼠肝癌细胞H22、小鼠肉瘤细胞S180及大肠癌HCT-8细胞生长的作用，Patlolla JM等报道β-七叶皂苷能够抑制小鼠ACF（结肠癌癌前病变）的形成，以及诱导HT-29人克隆结肠癌细胞凋亡的作用。但有关β-七叶皂苷抗白血病作用的研究目前尚未见报道。本实验旨在从细胞药效、整体动物药效和分子作用机理探讨的角度，多层次、多水平地研究β-七叶皂苷的抗白血病作用，为开发该药成为治疗白血病新药提供理论和实验依据，并为寻找、发现和合成新型抗癌先导化合物提供有用线索。实验所用β-七叶皂苷冻干粉针，为山东烟台绿叶制药有限公司产品，从七叶树科中国天师栗（Aesculus wilsonii Rebd）干燥成熟果实娑罗子（SemenAesculi）中提取；阿霉素为浙江海正药业股份有限公司产品。人急性髓细胞白血病（human acute myelogenous leukemia）细胞株HL-60、人慢性髓细胞白血病（human chronic mylogenous leukemia）细胞株K562及小鼠急性淋巴细胞白血病（murine lymphoid leukemia）细胞株P388和L1210由中科院上海生化细胞所细胞库提供。DBA／2近交小鼠，体重18-22g，由中科院上海实验动物中心提供。我们采用半固体集落培养法和台盼蓝拒染法观察β-七叶皂苷对HL-60和K562细胞的体外增殖抑制作用，采用MTT法观察β-七叶皂苷对P388细胞的体外增殖抑制作用；并建立P388和L1210小鼠淋巴细胞白血病移植模型观察β-七叶皂苷对体内荷瘤小鼠的生命延长率和小鼠腹水变化；实验进一步以HL-60和K562为靶细胞，采用细胞形态学观察、Annexin V-FITC／PI双标记法、DNA片断（DNA ladder）分析以及流式细胞仪分析DNA含量等方法观察β-七叶皂苷对白血病细胞的诱导凋亡作用，以探讨其分子作用机制。实验结果用SPSS 10．0 for windows统计软件分析处理，两组间差异比较采用Student’s t检验，多组资料之间的比较采用单因素方差分析，以P<0．05为差异具有显著性意义。IC₅₀应用GWBASIC（LOGIT）软件非线性回归计算获得。细胞药效学实验结果表明：30μg/ml的β-七叶皂苷作用于K562细胞24、48和72 h后，CFU-K562集落形成百分率分别为76．5±7．6％，49．5±5．4％和33．2±4．7％，与对照组的100％相比，具有明显的抑制作用（P<0．05）；50μg/ml的β-七叶皂苷作用于K562细胞24、48和72 h，CFU-K562集落形成百分率分别为30．5±5．2％，19．8±4．6％和11．2±3．6％，与对照组的100％相比，具有明显的抑制作用（P<0．01）。高浓度（70μg／ml）的β-七叶皂苷作用于K562细胞24、48和72 h，CFU-K562集落形成百分率接近零及等于零。低浓度（10μg/ml）的β-七叶皂苷对CFU-K562集落的形成没有影响。K562细胞与10，30和5μg/ml的β-七叶皂苷共同孵育24、48和72 h后，细胞活率无明显影响，但高浓度（70μg／ml）的β-七叶皂苷，使K562细胞活率明显下降，从原来的97．5±2．5％降到50％以下，呈现明显的细胞毒活性。30μg／ml的β-七叶皂苷作用于HL-60细胞24、48和72 h后，CFU-HL-60集落形成百分率分别为68．5±5．4％，45．2±4．9％and 33．2±5．7％，与对照组的100％相比，具有明显的抑制作用（P<0．05）；50μg／ml的β-七叶皂苷作用于HL-60细胞24、48和72 h，CFU-HL-60集落形成百分率分别为35．5±4．1％，27．8±3．2％and 16．2±2．9％，与对照组的100％相比，具有明显的抑制作用（P<0．01）。高浓度（70μg/ml）的β-七叶皂苷作用于HL-60细胞24、48和72h，CFU-HL-60集落形成率百分接近零及等于零。低浓度（10μg／ml）的β-七叶皂苷对CFU-HL-60集落的形成没有影响。HL-60细胞与10，30和50μg/ml的β-七叶皂苷共同孵育24、48和72h后，细胞活率无明显影响，但高浓度（70μg／ml）的β-七叶皂苷，使HL-60细胞活率明显下降，从原来的97．8±2．1％降到50％以下，呈现明显的细胞毒活性。β-七叶皂苷对体外培养的P388细胞也具有增殖抑制作用，并呈明显的浓度-效应和时间-效应关系。β-七叶皂苷作用P388细胞72小时IC₅₀为23．15±4．61μg／ml，与阿霉素联合用药具有协同作用。整体动物药效学实验结果表明：β-七叶皂苷对P388小鼠淋巴细胞白血病移植模型具有延长生命期作用，高（4．5 mg／kg）、中（3．5 mg／kg）、低（2．5mg／kg）剂量组对DBA／2近交小鼠移植性肿瘤的生命延长率分别为23．5％、29．4％和17．6％，其中高、中剂量组与对照组相比具有显著性差异（P<0．01）；阿霉素与β-七叶皂苷低剂量联合用药治疗组，生命延长率为47．1％与阿霉素治疗组（2mg／kg）的29．4％相比具有显著性差异（P<0．01）。β-七叶皂苷对L1210小鼠淋巴细胞白血病移植模型也具有明显的延长生命期作用，高（4．5 mg／kg）、中（3．5 mg／kg）、低（2．5 mg／kg）剂量组对DBA／2近交小鼠移植性肿瘤的生命延长率分别为25．8％、32．3％和12．9％，其中高、中剂量组与对照组相比具有显著性差异（P<0．01）；阿霉素与β-七叶皂苷低剂量联合用药治疗组，生命延长率为45．2％与阿霉素治疗组（2mg／kg）的29．0％相比具有显著性差异（P<0．01）。分子机理探讨结果显示：30和50μg／ml的β-七叶皂苷作用于K562细胞24 h后，细胞形态呈现明显的凋亡特征；Annexin V-FITC分析结果显示K562细胞经30和50μg／ml的β-七叶皂苷作用24 h后，Annexin V⁺和PI^-（早期凋亡）细胞分别占总细胞数的29．61±3．11％和40．71±4．32％，与对照组的1．58±0．97％相比结果具有显著差异（P<0．05）。DNA片断（DNA ladder）分析结果显示30和50μg／ml的β-七叶皂苷作用于K562细胞48和72h后，琼脂糖凝胶电泳显示180bp倍数的DNA ladder；DNA含量分析结果显示K562细胞经30和50μg／mlβ-七叶皂苷作用48h后，流式细胞仪直方图可见明显的细胞凋亡小峰Ap，即Sub-G1期细胞，分别占细胞总数的11．2±1．6％和33.2±3．1％，与对照组的1.3±0．6％相比具有显著性差异（P<0．05），同时伴随有G1-S期细胞周期阻滞现象。30μg／ml的β-七叶皂苷作用于HL-60细胞24、48和72 h后，细胞形态呈现明显的凋亡特征；AnnexinV-FITC分析结果显示HL-60细胞经20、30和50μg／ml的β-七叶皂苷作用24 h后，AnnexinV⁺和PI^-（早期凋亡）细胞分别占总细胞数的19．61±3．15％、55．15±5．11％和46．91±6．21％，与对照组的1．15±0．95％相比结果具有显著差异（P<0．05）。DNA片断（DNA ladder）分析结果显示20、30和50μg／ml的β-七叶皂苷作用于HL-60细胞48h后，琼脂糖凝胶电泳显示180bp倍数的DNA ladder；DNA含量分析结果显示HL-60细胞经30和50μg／ml的β-七叶皂苷作用48h后，流式细胞仪直方图可见明显的细胞凋亡小峰Ap，即Sub-G1期细胞，分别占细胞总数的21．8±3．6％和42．4±4．5％，与对照组的1．2±0．2％相比具有显著性差异（P<0．05），同时伴随有G1-S期细胞周期阻滞现象。综上所述，β-七叶皂苷（Beta-escin,aescin），一种从七叶树科中国天师栗（Aesculus wilsonii Rebd）干燥成熟果实娑罗子（Semen Aesculi）中提取的天然三萜皂苷类化合物，对HL-60人急性髓性白血病细胞、K562人慢性髓性白血病细胞和P388小鼠急性淋巴白血病细胞均具有较强的体外增殖抑制作用，作用呈明显的时间和剂量依赖性；高和中剂量的β-七叶皂苷作用于P388和L1210淋巴白血病移植小鼠，可明显延长荷瘤小鼠的生存时间，提高生命延长率。且低剂量的β-七叶皂苷与阿霉素具有协同作用，可以明显提高常规化疗药阿霉素的疗效。另外β-七叶皂苷还可以诱导K562和HL-60细胞凋亡和细胞周期阻滞，提示其抗白血病的作用机制与诱导细胞凋亡的分子途径有关。该研究为开发β-七叶皂苷成为治疗白血病新药提供理论和实验依据，并为寻找、发现和合成新型抗癌先导化合物提供有用线索。