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目的： 利用大肠杆菌高效表达肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段，并分析其与相应抗体的结合活性，进而明确表达产物用于鉴定和筛选基因工程抗体的可行性。设计引物分别克隆抗人肝癌单抗HAb18 Fd和轻链基因以及轻、重链可变区基因V_H和V_L，并构建成Fab抗体的形式对其可靠性和准确性进行验证。之后，利用克隆的抗体基因构建嵌合IgG抗体表达载体，转染SP2／O细胞进行稳定表达、纯化和鉴定。将轻、重链可变区基因V_L和V_H先后克隆入一个人鼠嵌合Fab抗体的通用载体，构建成cFab的分泌性表达载体，在大肠杆菌中进行诱导表达、纯化和鉴定。同时分别构建cFd和cL的原核非融合表达载体，诱导表达后，进行cFab复性的研究和产物鉴定。最终，对制备的三种基因工程抗体的抗原结合能力进行鉴定和初步比较。 方法：根据研究目的，实验内容共分为六个部分，操作方法简述如下。 1．肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段的原核表达与免疫学活性分析 以克隆载体pBluescript KS(+)／HAb18G为模板，应用PCR技术扩增出HAb18G胞外区基因片段。克隆入原核表达载体pGEX-4T-3后，酶切及测序鉴定阳性重组子。之后，通过IPTG进行诱导表达，并利用SDS-PAGE和Western-blot检测蛋白表达情况。对表达产物进行纯化及复性等处理后，采用ELISA等方法检测其 第四军医大学博士学位论文 免疫学的特性。2．抗人肝癌单克隆抗体HAbls轻、重链基因的克隆与鉴定 从杂交瘤细胞株中 提取总NA，利用RT－PCR扩增抗体Fd和轻链基因以及轻、重链可变区基 因人和 V。，分别连入 pMD18T载体后，进行序列测定并利用相应的软件对 序列进行分析。然后，将轻链及Fd基因依次克隆到载体pComb3中，构建成 噬菌体展示型表达载体pComb3／FdglllL。转化大肠杆菌XLlb山e并利用辅 助噬菌体M13卜＊进行挽救，收获噬菌体后利用间接＊NSA检测其抗原特异 性。另外，酶切去除载体pComb3／FdglllL的gill片段后，直接用连接酶将 其环化为分泌型的表达载体pComb3／Fab。转化大肠杆菌并诱导其表达，同时 采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的特异性。3．抗人肝癌基因工程嵌合IgG抗体的构建和表达 分别以克隆载体 pMD 18－T／VH和 pMD 18－T／VL为模板，用设计的含有相应酶切位点和内含子剪 切位点的特异引物扩增 HAb 8轻、重链可变区基因。克隆入真核表达载体 pDHL后，酶切及测序鉴定阳性重组载体pDHL／chHAbls。之后转染SP2／0 细胞，经 MTX筛选获得抗性克隆。采用有限稀释法单克隆化 PDHL／ChHAbl 阳性转染的SP2／0细胞，并持续MTX加压培养。通过ELISA从单克隆细胞 株中筛选高效表达的细胞株。表达产物利用 protein G亲合层析柱纯化后，进 行SDS．PAGE电泳和Western七b检测，同时采用ELISA和免疫荧光法检测 其抗原结合特异性。4．抗人肝癌基因工程嵌合Fab R体的构建及其在大肠杆菌中的分泌表达 利用 特异引物 PCR扩增人 IgG3的 CH和 C。基因，酶切后分别插入到表达载体 pComb3相应的酶切位点中，从而构建成人一鼠嵌合Fab抗体的通用表达载体 pComb3C。然后，将扩增的 MAb HAbls的 V。和 V。基因分别组装到通用表 达载体中，酶切去除gill片段后，直接连接成嵌合Fab抗体的分泌型表达载 体pComb3C／cFab。转化大肠杆菌XLI—Blue并诱导其表达，并通过ELISA 检测表达产物的定位。利用 protein G亲合层析柱纯化表达产物后，进行 SDS－PAGE电泳和 Western－blot检测，同时采用 ELISA和免疫荧光法检测表 达产物的特异性。5．抗人肝癌基因工程嵌合Fah抗体的原核非融 复性 以pComb3／cFab 第4 页 第四军医大学博士学位论文 为模板，分别用相应的弓l物扩增嵌合 Fd及嵌合轻链基因，酶切后分别插入到 原核表达载体pET32a相应的酶切位点中，从而构建成嵌合Fd及嵌合轻链的 原核非融合表达载体pET32a／cFd和 pET32a／CL。转化人肠杆菌 JM109（DE3） 并诱导其表达，SDS－PAGE电泳和 Western－blot检测表达情况。大量制备表达 的嵌合Fd及嵌合轻链后，按二者绝对量等摩尔比混合后进行透析复性。然 后，分别利用 SDS－PAGE电泳、Western．B！。t、HPLC和 ELISA对复性产物进 行分析和鉴定。6．抗人肝癌抗体RAbls、chHAb18和联合Fab亲和力的比较 利用竞争性 ELISA、间接ELISA和流式细胞仪检测。hHAbls、分泌表达cFab和复性cFab 的相对亲和力。结果：1．成功构建了肝癌相关抗原HAbl8G 胞外区片段的原核表达载体 PGEX－4T－3MAbl8GE，并在大肠杆菌中成功实现高效融合表达。表达蛋白相 对分子质量约为46Kll，表达量约占菌体总蛋白量的43％，表达产物主要以包 涵体形式为主。另外，表达蛋白在变性和非变性的条件下均可以与MAb HAbls特异性结合。2．成功地扩增出 HAbls Fd和轻链基因以及轻、重链可变区基因 V。和 V