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肺纤维化（PF）是一种十分常见的无法治愈的疾病,其特征是肺组织结构破坏以及瘢痕的形成[1]。随着科学技术的进步,尽管已经开发出各种检查和治疗的方法,但肺纤维化仍然是一个重要的公共卫生问题。随病程进展肺纤维化的患者不可避免地的出现进行性肺功能下降,最终导致呼吸衰竭,引发极高的死亡率[2,3]。越来越多的证据表明,肺纤维化的疾病机制涉及上皮-间质转化（EMT）[4,5]。在这种转分化过程中,上皮细胞最终转化为运动性间充质细胞,并出现胶原沉积和其他细胞外基质成分表达增加。气管支气管结核（TBTB）定义为气管和/或支气管的结核杆菌感染,气管支气管狭窄是气道纤维化的一种表现形式,也是TBTB最常见的并发症之一。目前对于因TBTB引起的气管支气管狭窄的治疗方法仍然十分有限。随着时间及病程的进展,TBTB引起的气道狭窄会逐渐恶化加剧,然而临床上可供医生和患者选择的治疗方法却寥寥无几。EMT使得气管支气管上皮细胞丧失上皮特征获得间质表型,是TBTB引起的气道纤维化（狭窄）的重要发病机制[6,7]。Micro RNAs（mi RNA/mi Rs）是小的内源性非编码RNA,可以通过与靶基因m RNA的3’-非翻译区（3’-UTR）结合来阻断翻译和/或加速靶m RNA的降解,由此调节基因表达[8]。越来越多的证据表明,mi RNA在各种生物学过程中起着关键作用,包括细胞增殖、分化、凋亡和EMT过程的调控[9-11]。近来,多项研究表明,miR-320a-3p可能涉及多种肿瘤的EMT调控[12,13]。但miR-320a-3p在纤维化疾病的EMT中的作用尚无报道,miR-320a-3p是否可以调节肺纤维化和气道纤维化中的EMT,且在此过程中是否存在共通机制尚不明确。在这项研究中,我们以A549细胞和BEAS-2B细胞构建了PF及TBTB的EMT细胞模型,通过细胞模型研究了miR-320a-3p在TGF-β1诱导的EMT中的作用,同时阐明了其潜在机制。目的:1.通过公共数据库挖掘,分析肺纤维化与正常对照组织中miR-320a-3p的表达水平,并分别在肺纤维化样本与正常对照肺组织样本,TBTB样本与正常对照气道样本中做差异表达的验证;2.通过miR-320a-3p模拟物来干预TGF-β1诱导构建的A549和BEAS-2B细胞模型来明确miR-320a-3p在EMT中的作用;3.在细胞分子水平上初步阐明miR-320a-3p抑制EMT作用的分子机制,探明miR-320a-3p在抑制肺及气道EMT方面是否存在着共通的机制,为PF和TBTB引起的气道纤维化（狭窄）提供新治疗靶标的相关线索。方法:1.依据纳排标准,对公共数据库Gene Expression Omnibus（GEO）和Array Express进行挖掘,分析数据集中miR-320a-3p的表达水平。2.收集PF,TBTB和正常对照的临床样本,q PCR方法验证miR-320a-3p的差异表达。3.构建细胞模型,q PCR方法在细胞模型中检测miR-320a-3p的表达水平。以miR-320a-3p模拟物干预TGF-β1构建的细胞EMT模型,通过q PCR,Western blot,以及免疫荧光染色等检测方法了解miR-320a-3p对EMT的作用。4.通过生物信息学工具预测miR-320a-3p的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因实验证实。通过Western blot实验研究miR-320a-3p对EMT作用的相关机制。结果:1.公共数据库中数据集的筛选以及临床样本和细胞模型中mi RNA表达差异的分析。依据事先设计的纳排标准,对GEO和Array Express数据库进行检索,一共纳入符合标准的数据集3个,共计174例样本。经统计发现,数据集中miR-320a-3p在纤维化样本和正常对照组中表达水平存在差异。接下来我们收集了肺纤维化样本与正常肺组织对照样本,通过检测其中的miR-320a-3p表达水平,发现与正常对照组相比,肺纤维化临床样本中的miR-320a-3p表达水平明显降低。其后又检测了TBTB样本与正常气道对照样本,经q PCR检测发现miR-320a-3p在TBTB样本中的表达较正常对照样本也明显降低。因此我们推论在肺与气道的纤维化中miR-320a-3p的表达与疾病存在相关性,并假设提高miR-320a-3p的表达水平可能影响肺和气道的纤维化。下一步,以TGF-β1刺激A549与BEAS-2B细胞构建PF与TBTB的EMT细胞模型。研究发现在不同浓度TGF-β1（0,1,3,5,和10ng/ml）刺激A549细胞与BEAS-2B细胞48小时作用下,A549细胞与BEAS-2B细胞中miR-320a-3p的表达较对照组明显下降,且呈现出浓度相关性。以10ng/ml TGF-β1在不同时间梯度下（0,24,48小时）刺激A549细胞与BEAS-2B细胞,再测定miR-320a-3p的表达水平,发现与对照组相比,48小时miR-320a-3p的表达下降最明显。2.miR-320a-3p能抑制TGF-β1诱导的EMT,并能抑制由TGF-β1诱导的细胞迁移能力增加。研究先用miR-320a-3p模拟物来干预A549细胞和BEAS-2B细胞,然后再给与TGF-β1刺激细胞。q PCR,Western blot以及免疫荧光染色结果显示:TGF-β1刺激可以使A549细胞及BEAS-2B细胞上皮标志物E-cadherin表达水平降低,同时使A549细胞及BEAS-2B细胞的间质标志物vimentin和α-SMA表达明显升高。而miR-320a-3p模拟物可以使TGF-β1刺激的A549细胞和BEAS-2B细胞E-cadherin表达水平较对单独TGF-β处理组明显升高,同时vimentin和α-SMA表达水平明显降低。针对BEAS-2B细胞,我们进一步进行了划痕实验以及实时细胞分析仪（RTCA）迁移能力测定。结果显示,TGF-β1的刺激可使BEAS-2B细胞迁移能力增强,miR-320a-3p模拟物的转染显著降低了BEAS-2B细胞的迁移能力,使TGF-β1刺激的细胞迁移能力降低至接近对照水平。3.miR-320a-3p抑制肺及气道上皮细胞EMT的分子机制利用生物信息学工具预测miR-320a-3p的靶基因,我们发现STAT3为miR-320a-3p的潜在目标靶基因。通过双荧光素酶报告基因实验证实了:miR-320a-3p能与野生型STAT3的3’-UTR区结合,而突变STAT3的3’-UTR区结合位点后,miR-320a-3p无法与之结合。接下来我们测定了miR-320a-3p模拟物干预的A549细胞和BEAS-2B细胞中STAT3的表达水平,实验发现,与TGF-β1处理组对比miR-320a-3p模拟物可明显降低A549细胞和BEAS-2B细胞中STAT3的表达。上述结果显示miR-320a-3p可能是通过靶向调控STAT3,从而起到抑制肺及气道上皮细胞EMT的作用。为了进一步证实miR-320a-3p是通过依赖STAT3的机制抑制了TGF-β1诱导的A549细胞和BEAS-2B细胞的EMT。首先,我们构建了si-STAT3和si-NC。用si-STAT3和si-NC转染A549细胞以及BEAS-2B细胞,然后给予10ng/ml TGF-β1刺激48小时,以Western blot实验评估两株细胞的上皮及间质标志物。结果显示:与TGF-β1处理组相比si-STAT3可以明显增加A549细胞和BEAS-2B细胞的E-cadherin表达水平,同时明显降低vimentin和α-SMA的表达水平。然后我们进行了回复实验:将miR-320a-3p模拟物与HBLV-h-STAT3或HBLV-NC共转染到A549细胞和BEAS-2B细胞中,给予10ng/ml TGF-β1刺激48小时后,再测定上皮及间质标志物的表达水平。结果显示:HBLV-h-STAT3显著增加了STAT3的表达。STAT3的上调抑制了miR-320a-3p模拟物对E-cadherin表达的影响,并显著增加了vimentin和α-SMA的表达。将研究进一步深入,我们分别以miR-320a-3p模拟物、si-STAT3、以及miR-320a-3p模拟物联合HBLV-h-STAT3来分别转染干预细胞模型。结果发现miR-320a-3p模拟物和si-STAT3干预可明显降低细胞p-SMAD3表达水平。而miR-320a-3p模拟物与HBLV-h-STAT3共转染可逆转由miR-320a-3p模拟物干预而导致的p-SMAD3表达降低。结论通过公共数据库挖掘和临床样本的测定,我们发现miR-320a-3p的表达水平在肺和气道纤维化组织中明显降低。miR-320a-3p与肺和气道纤维化的发生发展存在相关性。通过细胞实验,确定了过表达miR-320a-3p可以抑制由TGF-β1刺激诱导的A549细胞和BEAS-2B的上皮间质转换,其机制可能与STAT3/SMAD3信号通路相关。虽然疾病的类别有所不同,但对于肺和气道纤维化,miR-320a-3p在抑制二者的EMT方面是存在着共通机制的。本研究为miR-320a-3p成为可能的肺及气道纤维化的治疗靶标提供了理论依据。