背景和目的全球面临生育率下降和人口老龄化问题,不孕症是导致这两大问题的主要因素之一。近年来,不孕症的发病率不断上升,尽管有先进技术辅助治疗,10%患者仍存在顽固性不孕。反复种植失败（Recurrent implantation failure,RIF）已被认为是成功应用辅助生殖技术（Assisted reproductive technology,ART）的主要障碍和重大挑战,也是不良妊娠结局的主要原因。免疫治疗对改善RIF患者妊娠结局的有效性相关研究取得了一些进展,部分治疗方法也已被用于临床。但迄今为止,针对这一群体的免疫治疗尚缺乏高级别循证医学证据,免疫治疗对RIF患者的有效性依然充满争议。本研究利用文献计量学、网状Meta及队列研究对目前RIF的免疫治疗方案进行系统研究,其次采用生物信息学技术和病理实验寻求指导免疫治疗的目标基因,最后应用实时荧光定量PCR（Quantitative real time polymerase chain reaction,q RT-PCR）、Western Blot、免疫组织化学、细胞免疫荧光、细胞转染沉默基因表达、腺病毒过表达基因、体外球体粘附实验和体外动物囊胚-子宫内膜胚胎种植模型构建等方法研究目标基因CD40在RIF患者中表达情况并探索其发挥作用的可能分子机制,并进一步研究CD40在免疫治疗后的表达变化及这种变化对胚胎种植的影响,以期从筛选最优免疫治疗方案到基因指导免疫治疗两个方面为RIF患者个性化免疫治疗提供研究证据。方法1)文献计量学分析:在Web of Science核心数据库中检索2000年至2020年收录的关于RIF主题的文献。利用文献计量学方法对文献的发表数量、发文国家/机构分布、期刊收录、关键词共现、文献共被引等情况进行统计分析,并采用VOSviewer和Cite Space软件进行可视化分析。进一步筛选免疫治疗RIF的研究文献,利用VOSviewer软件分析关键词共现,并绘制关键词时间视图,根据关键词随时间的变化,了解该领域的研究现状和热点。2)网状Meta分析:系统地检索Cochrane Library、Pub Med、Embase和Web of Science数据库以及相关临床试验注册网站,并追踪相关的系统评价参考文献以筛选和纳入RIF免疫治疗的随机对照试验。采用Stata13.0软件进行随机效应网络Meta分析,比较各免疫调节剂在不同结局指标下的治疗效果,计算累积排序曲线下面积（Surface under the cumulative ranking curve,SUCRA）。最终,在不同妊娠结局指标下分别对各类干预措施进行概率排序,比较优劣。3)回顾性队列研究:根据纳入排除标准,收集接受外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）、富含血小板血浆（Platelet-rich plasma,PRP）或粒细胞集落刺激因子（Granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF）治疗的RIF患者和未接受任何免疫治疗RIF患者。采用单因素方差分析比较患者的基线信息及移植胚胎的情况,采用卡方检验比较不同治疗组胚胎种植率（Implantation rate,IR）和临床妊娠率（Clinical pregnancy rate,CPR）,评估不同治疗方案的临床疗效。4)免疫基因的筛选:从GEO数据库中下载数据集GSE16532,GSE120103和GSE92324。利用GEO2R筛选差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）。从Imm Port数据库下载免疫相关基因,取交集匹配获得差异表达免疫相关基因（Differential expression immune-related genes,DEIRGs）。对DEIRGs进行GO富集分析和KEGG通路分析。运用STRING在线软件构建DEIRGs的蛋白质-蛋白质相互作用网络（Protein-protein interaction,PPI）并基于Cytoscape软件可视化。通过Cyto Hubba和MCODE插件提取PPI中核心基因及重要模块。利用CIBERSORT软件获得组织中的免疫细胞浸润矩阵,Spearman相关性分析识别核心基因与免疫浸润细胞的相关性。利用基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）对候选基因进行GO和KEGG富集分析。受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）分析用于评估候选基因对RIF的诊断价值。最后收集临床子宫内膜标本,采用Western Blot和免疫组织化学方法验证生物信息学结果。5)目标基因的临床验证及机制探索研究:本研究收集了20例RIF患者和20例非RIF妇女子宫内膜组织标本,采用q RT-PCR方法检测CD40基因的表达水平,比较两组的表达差异。并通过转染sh CD40敲低Ishikawa细胞中CD40表达,检测TGF-β/Smad信号通路相关蛋白的表达。进一步利用TGF-β信号通路激活剂（SRI-011381）验证CD40是否调控TGF-β/Smad通路活性进而影响子宫内膜容受性。容受性标志物（HOXA10和ITGB3）表达变化和体外球体粘附实验用于评估子宫内膜上皮容受性。6)目标基因与免疫治疗预后关系研究:临床收集免疫治疗的RIF患者和未接受免疫治疗的RIF患者子宫内膜组织,采用q RT-PCR和Western Blot方法检测CD40基因及蛋白在RIF子宫内膜组织中的表达水平,并在体外细胞模型中,通过q RT-PCR、Western Blot和细胞免疫荧光方法验证给予rh G-CSF刺激后CD40表达变化;同时采用体外动物囊胚-子宫内膜胚胎种植模型来阐述CD40表达变化和免疫治疗对胚胎植入程度的影响;最后,通过免疫组织化学实验观察体内给予免疫治疗后CD40与患者妊娠结局的关系,并进一步利用Be Wo球状体铺展实验观察体外给予rh G-CSF后CD40表达与胚胎植入能力的关系。结果1)文献计量学分析最终纳入1764篇文献,近年来RIF的研究热度持续不减,相关文献发表量逐年呈现稳定增长的趋势,美国发文量最多,中国紧跟其后。载文量最多的期刊为Fertility and Sterility。通过PRP和G-CSF等免疫治疗改善妊娠结局是当前RIF研究领域涉及的研究热点主题之一。分析免疫治疗RIF的研究现状和热点,结果表明研究者长期致力于研究RIF发生的免疫病因和机制,新型治疗方案研发和妊娠结局改善等主题成为该领域关注的热点。2)网状Meta分析纳入21项研究,涉及2277名参与者和8种免疫疗法。PBMCs、G-CSF、脂肪乳剂、PRP和西罗莫司均能有效地改善患者的临床妊娠率,排名第一的为西罗莫司,其次是PBMCs、PRP、G-CSF和脂肪乳剂;在胚胎种植率方面,PBMCs和G-CSF明显优于安慰剂。在活产率方面,PBMCs和西罗莫司是有效的。然而,重组人白血病抑制因子（Recombinant human leukemia inhibitory factor,r-h LIF）具有降低活产率的风险。在流产率方面,没有治疗方案可以降低流产风险,但是PBMCs在降低流产率方面的排名最高。3)回顾性队列研究纳入156例RIF患者,其中PBMCs治疗组30人,PRP治疗组30人,G-CSF治疗组31人,空白对照组65人。比较四组基线资料特征,除胚胎移植日子宫内膜厚度有差异,其它特征差异无统计学意义（P＞0.05）。妊娠结局比较显示,PBMCs治疗组的IR和CPR分别为29.8%、46.7%;PRP治疗组的IR和CPR分别为33.9%、50.0%;G-CSF治疗组的IR和CPR分别为30.4%、45.2%;对照组的IR和CPR分别为16.9%、23.1%;卡方检验显示三种免疫治疗方案在改善妊娠结局上无统计学差异（P＞0.05）,但与对照组相比,RIF患者IR和CPR改善,差异有统计学意义。4)在GSE16532数据集中,筛选出124免疫相关差异基因。构建PPI网络后获取24个枢纽基因。免疫细胞浸润矩阵分析结果表明,与对照组相比,不孕组M0巨噬细胞和静息肥大细胞显著增加（P＜0.05）,而活化的NK细胞显著减少（P＜0.05）。分析24个枢纽基因与M0巨噬细胞、静息肥大细胞或激活的NK细胞相关性,共筛选出17个与免疫微环境紊乱显著相关的基因,并在GSE120103独立数据集中验证。进一步在GSE92324数据集中验证这17个基因,发现CD40、PRF1和EDN3三个基因在RIF与正常怀孕妇女间差异表达。GSEA分析发现三个基因参与多个免疫生物过程,在免疫通路有富集。ROC分析发现三个基因对RIF具有良好的诊断价值,CD40的AUC为0.951,EDN3的AUC为1.000,PRF1的AUC为0.778。最后利用临床病理实验验证发现CD40、PRF1和EDN3在RIF患者中低表达。5)本研究总共纳入20例RIF患者和20名非RIF女性,验证CD40的表达差异,并探究其在RIF中可能的作用机制。结果表明CD40在RIF组子宫内膜组织中的表达水平降低,其低表达与Ishikawa细胞的球体附着率降低相关,同时其低表达抑制细胞中TGF-β/Smad信号通路活性。进一步发现SRI-011381激活TGF-β/Smad信号通路后可以显著提高Ishikawa细胞的球体附着率和容受性标志物的表达,而敲低CD40能够抑制SRI-011381在Ishikawa细胞中的作用。6)总共纳入24例RIF患者,免疫治疗组CD40 m RNA及蛋白表达均高于对照组（P＜0.05）;体外Ishikawa细胞给予rh G-CSF刺激后,CD40 m RNA及蛋白水平均升高（P＜0.05）,细胞免疫荧光实验结果显示rh G-CSF刺激Ishikawa细胞组CD40蛋白明显表达;在铺展实验中,腺病毒感染单层Ishikawa细胞高表达CD40后或者给予rh G-CSF刺激后,小鼠胚胎的铺展面积均高于对照组;收集的30例给予免疫治疗的RIF子宫内膜标本中,CD40高表达患者比低表达患者具有更好的胚胎种植率（?2=5.334,P=0.021）。而两组临床妊娠率（?2=1.833,P=0.176）和活产率（?2=1.632,P=0.201）比较无统计学差异。Be Wo球状体铺展实验发现CD40低表达的Ishikawa细胞限制了Be Wo细胞球的扩张面积,而这种抑制可以被rh G-CSF刺激所逆转。结论1)免疫治疗是RIF研究的前沿领域之一。研究者长期致力于研究RIF发生的免疫病因和机制。而针对各病因开发新治疗方案提供个性化治疗,最终改善妊娠结局是免疫治疗RIF研究领域的热点。2)免疫治疗有望成为改善RIF患者妊娠结局的重要措施之一,然而最优的免疫治疗方案尚存争论。本研究发现PBMCs、PRP和G-CSF三种治疗方案在有效改善RIF患者妊娠结局方面更具优势,可能是未来RIF的有益治疗选择。3)CD40、EDN3和PRF1基因参与RIF发生进展,影响免疫微环境平衡,并在RIF诊断上有良好的诊断效能。其中,CD40可能通过TGF-β/Smad信号通路影响内膜容受性,成为导致反复植入失败的关键基因,其在指导RIF免疫治疗方面具有价值,有可能作为RIF潜在诊疗靶标指导RIF患者个性化免疫治疗。EDN3和PRF1对免疫治疗的指导意义有待进一步研究。