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肉牛是沙门氏菌的携带者,沙门氏菌极易通过粪便、皮毛及交叉污染散播到肉牛屠宰和加工环境中,并能够在刀具、分割板、传送带等肉品加工接触表面形成生物膜,由于其特殊组织结构使得生物膜可以抵抗常规的杀菌消毒策略,进而成为沙门氏菌重要的污染源头,极易引起严重的交叉污染和加工后污染。多起因沙门氏菌生物膜引发的食品中毒事件已被证实。目前,国外已有许多关于沙门氏菌生物膜的研究,但试验沙门氏菌多来源于禽类、水产、碎肉、病体或为标准菌株,牛肉源沙门氏菌生物膜的研究并不多见,这对了解实际加工环境下沙门氏菌生物膜的形成情况存在一定的局限性。因此,本实验选取了76株来源于我国肉牛屠宰厂中不同屠宰工序的沙门氏菌和一株ATCC14028标准菌株,共8种血清型作为试验菌株,根据我国肉牛屠宰加工的实际生产条件,设置温度(4℃、10℃、25℃、37℃和42℃)和p H值(4.5、5.0、5.5、6.0、7.0和8.0),采用96孔板结晶紫定量法对试验菌株在不同温度和pH值下生物膜的形成能力进行测定,然后采用普通PCR技术对全部试验菌株中24个生物膜相关功能基因进行鉴定,最后利用实时荧光定量PCR技术进一步对比分析相关功能基因在浮游状态、生物膜状态以及不同温度和pH值下的相对表达情况。本实验的研究结果如下:全部试验菌株在25℃和37℃下均能形成生物膜;沙门氏菌不同血清型间生物膜形成能力存在显著差异(P<0.05),试验菌株中S.Senftenberg和S.Kingston生物膜形成能力较强,同种血清型不同菌株其生物膜形成能力不同;结果说明我国肉牛屠宰企业具有较高的沙门氏菌生物膜的安全风险。沙门氏菌血清型、培养温度和pH值的交互作用显著影响沙门氏菌生物膜的形成能力;沙门氏菌成膜的最适温度为25℃,最适p H值为7.0;在4℃下不受pH值的影响,均不能形成生物膜;在10℃或25℃下,沙门氏菌在酸性环境中生物膜的形成能力显著增强。从微生物安全角度考虑,在肉牛屠宰加工过程中应严格保证低温操作以降低沙门氏菌生物膜形成的风险。在全部试验菌株中基因rpoS、fliC、wcaA和invA的检出率100%,基因csgB、csgD、csrA、sirA、adrA、gly、fimH、sdiA、ompR、sipB、sipC、luxS和pfs在不同成膜能力株中的检出率均大于75%,以上基因可能对生物膜的形成发挥一定作用;基因igaA的检出与成膜能力存在显著相关性(χ~2=7.94,P=0.02);结果说明不能通过单个基因的检出判定沙门氏菌的成膜能力,生物膜的形成并不是单个基因表达调控的,其中可能涉及到复杂的基因间的协同表达和其他因素的调控。沙门氏菌粘附基因、调控基因和群体感应基因的表达受菌体状态和培养环境的显著影响。随着培养时间的延长,浮游菌中csgD表达量显著降低,sirA和群体感应基因表达量显著增加,生物膜中基因csgD、rpoS和群体感应基因在成膜初期发挥重要作用,粘附基因和调控基因在成膜成熟期后发挥重要作用,全部基因在成膜6 d时表达量达到最大;随着培养温度的升高,生物膜中功能基因表达水平呈先增加后减小或持续增加的趋势,温度对调控基因的影响作用更显著;随着pH值的升高,生物膜中基因表达先增加后减小,低pH值通过控制adrA、sdiA、ompR和sirA的表达影响沙门氏菌生物膜的形成;在生物膜形成过程中基因rpoS和ompR对csgD的表达表现出调控功能。这些结果表明不同状态和环境下,沙门氏菌生物膜功能基因的调控机制不同。