背景及目的： 肾移植是治疗终末期肾脏病理想的方法，成功的肾移植可使移植肾具有较高的长期存活率，术后患者的长期存活率和生活质量也高于透析患者。目前，肾移植手术本身已经是比较成熟的技术，影响移植肾存活率的主要因素是肾移植的内科处理，其中移植免疫干预最有治疗价值。T细胞是识别同种异型抗原、介导移植排斥反应的关键细胞，其完全激活需要两条途径：抗原提呈细胞（APC）提呈的抗原肽-MHC复合物与T细胞表面的TCR结合（第一信号），T细胞表面的共刺激分子（CD28、CD40L等）与APC表面的配体（B7、CD40等）结合（第二信号）[1，38]。CD4+Th1细胞介导的迟发型超敏反应是造成移植物损伤的主要机制；CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和CD4+CTL可直接杀伤表达异型抗原的移植物细胞；除T细胞外，其它免疫效应细胞（如巨噬细胞、NK细胞等）和免疫效应分子（如抗体、补体等）也在一定程度上参与急性排斥反应的组织损伤[1]。已有研究阐明，细胞毒性T淋巴细胞抗原4免疫球蛋白（CTLA4Ig）可通过与CD28竞争结合B7阻断T细胞活化所必需的第二信号而抑制其活化、增殖，诱导免疫耐受，在自身免疫性疾病、移植排斥的治疗中取得较好的效果[1-2，33-34]。近年，通过腺病毒介导CTLA4Ig基因转移，可在体内获得较持久、有效的表达，显著延长移植物的存活时间，但许多研究尚未得到稳定一致的结果[3-6，26-32]。也已有研究阐明，未成熟树突状细胞（DC）倾向于诱导免疫耐受，而成熟DC倾向于引发免疫排斥反应；未成熟DC不表达共刺激分子，它和抑制性DC亚群可以通过诱导调节或抑制性细胞来清除免疫反应性T细胞，也可以直接产生白细胞介素（IL）-10、B转化生长因子（TGF-β）等细胞因子而抑制免疫反应性T细胞，从而诱导免疫耐受[1，7]。Th1和Th2细胞在免疫应答中具有重要的作用，Th1型细胞因子主要促进免疫排异反应及组织损伤，Th2型细胞因子常产生抑制性信号，诱导移植免疫耐受，也辅助B细胞增殖并产生抗体，参与体液免疫应答，其机制尚未完全阐明[1，35-37]。此外，动物实验研究发现，体内CTLA4Ig基因表达与腺病毒中和抗体的效价成负相关系：随着腺病毒中和抗体效价的增加，CTLA4Ig基因表达逐渐下降，甚至再次使用CTLA4Ig重组腺病毒（Ad-CTLA4Ig）时其效能下降或消失，不能维持稳定的移植免疫耐受[4]。 据上面所述，促进Th细胞由Th1向Th2偏移可诱导移植免疫耐受，但存在的问题是：Th2细胞同时也可以辅助B细胞活化、增殖并产生抗体，加速Ad-CTLA4Ig的清除，使CTLA4Ig的表达衰减甚至消失。由于未成熟DC具有致耐受的特点（上面已述），我们试图将Ad-CTLA4Ig修饰未成熟DC，进行动物实验作初步的研究。研究目的为：（1）探讨经Ad-CTLA4Ig修饰的未成熟DC对大鼠Th细胞增殖的影响；（2）探讨经Ad-CTLA4Ig修饰的未成熟DC能否减少或消除腺病毒中和抗体的负面影响，维持CTLA4Ig的稳定表达，诱导有效的移植免疫耐受，延长大鼠移植肾的存活时间。 方法： 1.经酶切、PCR鉴定Ad-CTLA4Ig[21]。 2.Ad-CTLA4Ig修饰未成熟DC：（1）制备未成熟DC：抽取Wistar大鼠（第二部分为受体鼠）骨髓并按参考文献[8]的方法分离、培养获得未成熟DC，用MiniMACS免疫磁性分离系统纯化并调整细胞密度。（2）修饰：用梯度超速离心法纯化Ad-CTLA4Ig，用空斑法调整其滴度，然后与上述调定密度的未成熟DC于37℃共孵化6小时（h）。用荧光显微镜了解Ad-CTLA4Ig转染DC的情况。 3.Ad-CTLA4Ig修饰的未成熟DC对大鼠Th细胞增殖的影响 （1）实验大鼠的分组及注射：将29只Wistar大鼠随机分成4组[实验组1组（n=8），对照组3组（每组n=7）]。实验组经尾静脉注射经Ad-CTLA4Ig修饰的未成熟DC，对照组经同样方法分别注射未成熟DC、Ad-CTLA4Ig及生理盐水（NS）。 （2）提取Th1、Th2及CD4+T细胞（即总Th细胞）：取大鼠脾脏，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞（LC），经流式细胞术分选相应的细胞。 （3）检测指标：经混合淋巴细胞培养（MLC）检测Th1、Th2及总Th细胞的增殖活性，用免疫组织化学法计算Th1、Th2的比例，用ELISA法检测血清CTLA4Ig。 4.Ad-CTLA4Ig修饰的未成熟DC对大鼠移植肾存活的影响 （1）实验大鼠的分组及术前处理：将受体Wistar大鼠随机分为4组，每组12只（1组实验组，3组对照组）。术前7天（d）将实验组每只受体鼠经腹腔注射经Ad-CTLA4Ig修饰的未成熟DC。另分别设Ad-CTLA4Ig、重组腺病毒空载体（Ad-VG）、NS腹腔注射为对照。在移植术前，对SD大鼠行尿常规、肾功能检查，正常者随机入选为供体。 （2）建立大鼠肾移植模型：将供体SD大鼠肾异位移植至受体Wistar大鼠颈部（分别将供肾动、静脉和受体颈总动脉、颈外静脉作端端吻合），受体双肾保留不变。 （3）检测指标：观察移植肾的存活时间，移植肾的病理（光镜及透射电镜切片），受体鼠的免疫状态[以混合淋巴细胞反应（MLR）检测受体鼠的免疫耐受程度，用X-半乳糖苷酶染色法测定血清腺病毒中和抗体滴度，ELISA法检测血清CTLA4Ig]。 5.统计学方法：正态分布数据均用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用SNK-q检验，偏态分布数据的比较用Wilcoxon秩和检验，P<0.05表示差别有统计学意义。作图及统计处理借助Excel及SPSS软件。 结果： 1.Ad-CTLA4Ig经酶切、PCR鉴定含有CTLA4Ig目的基因。 2.Ad-CTLA4Ig修饰的未成熟DC内可观察到增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达，空白对照未能观察到。 3.Ad-CTLA4Ig修饰的未成熟DC对大鼠Th细胞增殖的影响 （1）实验组血清CTLA4Ig水平（0.65±0.13）著高于Ad-CTLA4Ig组（0.39±0.10，P<0.01），DC组及NS组未检出。 （2）实验组Th1细胞的增殖指数（742±161）、Th1/Th2（0.16±0.05）均显著低于各对照组（分别与未成熟DC组、Ad-CTLA4Ig组、NS组相比，P均<0.01），而Th2细胞的增殖指数（9162±598）显著高于各对照组（P均<0.01）。Ad-CTLA4Ig修饰的未成熟DC对大鼠Th细胞增殖的影响是非对称性的。 4.Ad-CTLA4Ig修饰的未成熟DC对大鼠移植肾存活的影响 （1）Ad-CTLA4Ig修饰的DC组移植肾存活时间[（94.6±7.3）d]较对照组显著延长[Ad-CTLA4Ig组（39.6±8.0）d，P<0.01；Ad-VG组（8.6±2.2）d及NS组（8.4±2.0）d，P均<0.001]。 （2）光镜及电镜组织学损伤、腺病毒中和抗体滴度均较对照组显著减少（除外：与NS组相比，腺病毒中和抗体滴度无显著差异）。 （3）血清CTLA4Ig水平较Ad-CTLA4Ig组显著升高，Ad-VG及NS组未检测出。 （4）Ad-CTLA4Ig修饰的DC组受体鼠淋巴细胞对SD大鼠相关抗原的刺激指数[SI，（1.1±0.3）]显著低于Ad-CTLA4Ig组[（7.5±0.8），P<0.01]、Ad-VG组及NS组[（21.9±1.2），（22.4±1.8），P均<0.001]；对BN大鼠无关抗原的SI（4.1±0.6）显著低于Ad-CTLA4Ig组[（13.7±0.9），P<0.01]、Ad-VG及NS组[（22.7±1.6），（23.9±2.1），P均<0.001]。各组内SD大鼠相关抗原刺激的SI显著低于BN大鼠无关抗原（P均<0.01，Ad-VG组及NS组除外）。 结论： 1.Ad-CTLA4Ig修饰的未成熟DC可显著抑制大鼠Th1细胞增殖，促进Th2细胞增殖，使Th细胞由Th1向Th2显著偏移，它对大鼠Th细胞增殖的影响是非对称性的。 2.Ad-CTLA4Ig修饰的未成熟DC可减少受体鼠内腺病毒中和抗体，维持CTLA4Ig的稳定表达，诱导有效的移植免疫耐受，减轻大鼠移植肾的病理损伤，延长其存活时间。 3.腺病毒中和抗体是Ad-CTLA4Ig转基因表达的抑制因素，设法减少腺病毒中和抗体可明显提高Ad-CTLA4Ig的治疗效果。