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研究背景及目的缺血性脑损伤是临床上常见的疑难问题,常见的病因包括心脏骤停、中风、围术期多种因素引起的脑缺血等。它不仅是老年人致残、致死的主要病因,近些年也严重危害着青少年的健康。明确脑缺血再灌注损伤的内在机制对于治疗缺血性脑损伤具有重要意义。星形胶质细胞(Astrocyte, AS)是多功能的细胞,被认为是大脑细胞结构及功能的基石,广泛存在于中枢神经系统。脑缺血后,AS发生活化,出现反应性增殖。但AS的反应性增殖在脑缺血后神经功能恢复中的作用有利有弊。在缺血的初始阶段,AS可保护正常脑组织细胞免受到毒性物质的伤害,并分泌神经营养因子为神经元的再生提供底物。然而,在损伤的后期阶段,活化的AS会导致胶质瘢痕的形成,从而构筑一个物理以及生化屏障阻碍轴突的再生,严重损害缺血后神经功能的恢复。因此明确缺血性脑损伤后AS发生反应性增殖的内在机制并及早抑制其增殖可以阻碍胶质瘢痕的形成,可为神经再生提供适宜的内环境,最终加强缺血性脑损伤后的康复。以往研究显示,在肿瘤细胞或是可增殖细胞中,细胞异常增殖伴随着糖酵解途径的激活。PFKFB3是糖酵解关键酶PFK1最有效的变构激活剂,在快速增殖的细胞中PFKFB3有大量表达,且主要定位于细胞核中,糖酵解被激活。但糖酵解与细胞增殖之间相互影响的具体机制尚不清楚。真核细胞的增殖依赖于细胞周期末期促进复合物(Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome, APC/C)的活性。Cdh1为APC/C的重要调节分子,当细胞处于在有丝分裂末期及G1期时,Cdh1 与 APC/C形成复合物,通过泛素化降解多种底物蛋白,调控细胞周期的进程。近年新的研究表明,APC/C-Cdh1可识别PFKFB3所含的KEN box将其泛素化降解。我们的前期研究发现,大鼠全脑缺血模型中海马组织中的Cdh1的活性下调,且离体氧糖剥夺再复氧后星形胶质细胞中Cdh1的含量降低。星形胶质细胞在生理状态下可表达高水平的PFKFB3,而APC/C-Cdh1活性较低。因此,我们进一步推测,在脑缺血再灌注损伤这一病理过程中,APC/C-Cdhl可通过泛素化降解糖酵解关键酶PFKFB3,调控星形胶质细胞中的糖酵解,进而抑制星形胶质细胞的反应性增殖。氧糖剥夺再复氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion, OGD/R)模型是一种离体模拟缺血缺氧性脑损伤的实验方法,已有研究证实,该方法可引起星形胶质细胞的反应性增殖。因此本研究拟构建离体大鼠大脑皮层星形胶质细胞OGD/R模型,观察氧糖剥夺对星形胶质细胞的糖酵解的影响,并通过构建慢病毒或siRNA特异性上调或下调糖酵解关键酶的表达探究糖酵解变化与细胞增殖的内在联系；此外采用Cdh1过表达慢病毒或干扰慢病毒调节Cdh1的活性,探究Cdh1变化对OGD/R后星形胶质细胞糖酵解及增殖影响。本实验旨在观察氧糖剥夺对体外培养星形胶质细胞糖酵解的影响,以及糖酵解的变化是否参与并调控OGD/R后星形胶质细胞反应性增殖,进而从糖酵解的角度,探讨其在APC/C-Cdhl调控后星形胶质细胞反应性增殖的作用,为明确缺血后星形胶质细胞反应性增殖的机制提供新思路。研究方法及结果1.大鼠大脑皮层星形胶质细胞氧糖剥夺再复氧模型的构建及鉴定方法：离体纯化的成熟大鼠皮层星形胶质细胞,随机分为对照组(Control)及氧糖剥夺再复氧组(OGD/R组)。OGD/R组加入无糖DMEM培养基,置入密闭缺氧小室内,不断通入混合气体(含5%CO2,95%N2),37℃培养3h后更换为标准培养液,置于37℃三气培养箱复氧24 h；对照组不进行缺氧处理。24 h后细胞免疫荧光检测星形胶质细胞标志物GFAP与PCNA的表达,western blot检测PCNA蛋白的表达。结果：与Control组相比,OGD/R组星形胶质细胞中PCNA阳性细胞数以及PCNA蛋白含量明显增加(P<0.05),表明氧糖剥夺再复氧模型构建成功。2.OGD/R对星形胶质细胞糖酵解关键酶mRNA及蛋白表达水平的影响方法：体外纯化的大鼠大脑皮层星形胶质细胞随机分为对照组(Control)及氧糖剥夺再复氧组(OGD/R组)。OGD/R组氧糖剥夺3 h,复氧24 h。对照组不进行缺氧处理。结束后,分别提取细胞总mRNA及蛋白,采用RT-PCR及westernblot检测OGD/R后星形胶质细胞糖酵解关键酶PFKFB3及PFK1在mRNA及蛋白水平的表达变化。结果：RT-PCR结果显示,PFKFB3、PFK1与β-actin产物的熔解曲线均具有特异性,与Control组相比,OGD/R后PFKFB3 mRNA表达上调(P<0.05),而PFK1 mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。western blot显示,OGD/R后星形胶质细胞中PFKFB3与PFK1蛋白表达与Control组相比均明显增加(P<0.05)。3.PFK1过表达慢病毒干预对OGD/R后星形胶质细胞增殖的影响方法：将纯化后的星形胶质细胞随机分为四组：对照组,OGD/R组,OGD/R+PFK1-LV组和OGD/R+PFK1-CV组。慢病毒处理组加入PFK1过表达慢病毒或对照慢病毒(MOI=10),感染3天后,进行OGD/R处理。采用EdU、western blot检测不同处理干预后星形胶质细胞的增殖情况。结果：EdU检测显示,与OGD/R+PFK1-CV组相比,PFK1过表达慢病毒组EdU阳性率明显增加(P<0.05); Western blot结果显示,与PFK1-CV组相比,PFK1过表达慢病毒组PCNA蛋白表达增加(P<0.05)。4. PFKFB3 siRNA可抑制OGD/R后星形胶质细胞的反应性增殖方法：将纯化后的星形胶质细胞随机分为四组：对照组,OGD/R组,OGD/R+PFKFB3 siRNA组(OGD/R+siPFKFB3组)和OGD/R+阴性对照siRNA组(OGD/R+NC siRNA组)。siRNA干预组加入PFKFB3 siRNA或对照siRNA,转染3天后,进行OGD/R处理。采用EdU、western blot检测不同处理干预后星形胶质细胞的增殖情况。结果：EdU检测显示,与OGD/R+NC siRNA组相比,OGD/R+siPFKFB3组EdU阳性星形胶质细胞比例明显降低(P<0.05);western blot检测显示,与OGD/R+NC siRNA组相比,OGD/R+siPFKFB3组PCNA蛋白表达下调(P<0.05)。5. PFKFB3 siRNA可抑制OGD/R后星形胶质细胞中糖酵解的激活方法：将纯化后的星形胶质细胞随机分为四组：对照组,OGD/R组,OGD/R+siPFKFB3组和OGD/R+NC siRNA组。siRNA干预组加入PFKFB3 siRNA或对照siRNA,转染3天后,进行OGD/R处理。收集培养基和提蛋白。采用western blot检测不同处理组糖酵解关键酶的蛋白表达变化,分光光度计检测各组培养基中乳酸含量。结果：Western blot显示,与OGD/R+NC siRNA组相比,OGD/R+siPFKFB3组PFKFB3与PFK1蛋白表达减少(P<0.05)；分光光度计检测各组培养基中乳酸含量结果显示：与OGD/R+NC siRNA组相比,OGD/R+siPFKFB3组乳酸释放明显受到抑制(P<0.05)6. Cdhl过表达慢病毒干预对OGD/1R后星形胶质细胞糖酵解的影响方法：将纯化后的星形胶质细胞随机分为四组：对照组,OGD/R组,OGD/R+Cdh1过表达慢病毒组(OGD/R+Cdh1-LV组)和OGD/R+对照慢病毒组(OGD/R+Cdh1-CV组)。慢病毒处理组慢病毒感染3天后,进行OGD/R处理。收集培养基和提蛋白。采用western blot检测不同处理组糖酵解关键酶的蛋白表达变化,分光光度计检测各组培养基中乳酸含量变化。结果：Western blot结果显示,与OGD/R+Cdhl-CV相比,Cdh1过表达慢病毒组中星形胶质细胞Cdh1明显增加(P<0.05), PFKFB3、PFK-1蛋白表达下降(P<0.05)；分光光度计检测各组培养基中乳酸含量结果显示：与对照病毒组相比,Cdh1过表达慢病毒组乳酸释放明显受到抑制(P<0.05)。7.Cdhl干扰慢病毒对星形胶质细胞感染效率的确定方法：采用Cdhl干扰慢病毒及对照慢病毒,分别以MOI为1、5、10和20感染星形胶质细胞,感染72 h后,在倒置荧光显微镜下,观察绿色荧光蛋白GFP的表达,确定最佳MOI。将纯化的星形胶质细胞随机分为Control组,Cdhl干扰慢病毒组(siCdhl-LV组)和对照慢病毒组(siCdhl-CV组),以最佳MOI感染星形胶质细胞,提蛋白,western blot检测Cdhl干扰慢病毒干预对Cdhl蛋白表达的影响。结果：荧光结果显示,MOI为1、5、10、20感染星形胶质细胞均能观察到GFP表达。当MOI=10时即可达到较好转染效果,从经济角度,选择MOI为10进行后续实验。Western blot显示：与Control组和siCdhl-CV组相比,Cdhl干扰慢病毒组Cdh1的表达明显下降(P<0.05)。8. Cdhl干扰慢病毒干预对OGD/1R后星形胶质细胞中PFKFB3表达的影响方法：将纯化后的星形胶质细胞随机分为四组：对照组,OGD/R组,OGD/R+Cdh1干扰慢病毒组(OGD/R+siCdh1-LV组)和OGD/R+对照慢病毒组(OGD/R+siCdh1-CV组)。慢病毒处理组慢病毒感染3天后,进行OGD/R处理。提蛋白,采用western blot检测不同处理组糖酵解关键酶的蛋白表达变化。结果：Western blot检测结果显示,与siCdhl对照慢病毒组相比,Cdh1干扰慢病毒组中星形胶质细胞PFKFB3蛋白表达进一步增加(P<0.05)。9.Cdhl干扰慢病毒干预与siPFKFB3单独或联合干预对OGD/R后星形胶质细胞中PFKFB3表达及增殖的影响方法：将纯化后的星形胶质细胞随机分为五组：Contro1组,OGD/R组,OGD/R+siCdh1-LV+siPFKFB3组,OGD/R+siCdh1-LV+NC siRNA组和OGD/R+ siCdhl-CV+siPFKFB3组)。慢病毒与siRNA联合干预组,慢病毒感染8 h后,加入siRNA,继续培养3天后,进行OGD/R处理。提蛋白,采用western blot检测不同处理组糖酵解关键酶及PCNA的蛋白表达变化。结果：Western blot显示,与对照慢病毒组相比,Cdhl干扰慢病毒组中星形胶质细胞PFKFB3与PCNA蛋白的表达进一步上调(P<0.05),采用PFKFB3siRNA联合干预,可逆转Cdhl干扰慢病毒干预后星形胶质细胞PFKFB3与PCNA蛋白的表达(P<0.05)10.统计学处理采用SPSS20.0统计软件对数据进行分析,计量资料以均数士标准差(x±s)表示,两组间比较使用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。一、主要研究结果1.离体实验发现,糖酵解关键酶PFK1及PFKFB3蛋白高表达于大鼠皮层星形胶质细胞,且主要定位于细胞核中。氧糖剥夺再复氧处理可上调星形胶质细胞中PFK1及PFKFB3的表达及细胞的糖酵解能力。2.离体实验证实,PFK1过表达慢病毒上调星形胶质细胞中PFK1蛋白的表达,可增强细胞糖酵解,进而加剧OGD/R后细胞的反应性增殖：反之,采用siRNA下调PFKFB3蛋白可降低细胞糖酵解,从而抑制细胞的反应性增殖。3.离体实验证实,Cdh1过表达慢病毒可抑制星形胶质细胞中PFKFB3、PFK1的表达及乳酸的释放,进而抑制星形胶质细胞增殖；反之,Cdhl干扰慢病毒加剧OGD/R后星形胶质细胞中PFKFB3表达的增加,联合使用PFKFB3 siRNA干预,可逆转该效应。二、研究结论：氧糖剥夺再复氧可明显增加星形胶质细胞中糖酵解关键酶PFKFB3及PFK1的表达且缺血脑损伤引起的星形胶质细胞的反应性增殖伴随着糖酵解途径的激活。调控P FKFB3与PFK1的表达可影响氧糖剥夺后细胞的反应性增殖,且氧糖剥夺后星形胶质细胞的糖酵解能力与细胞的增殖程度成正相关。Cdh1是PFKFB3的上游调节蛋白,采用慢病毒调节Cdh1的活性,可调控PFKFB3的泛素化降解与PFK1的表达,进而影响糖酵解的激活,参与OGD/R后星形胶质细胞的反应性增殖。