研究背景乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）感染后可引起无症状携带、慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B，CHB）、肝硬化（Liver Cirrhosis，LC）及肝癌（Hepatocellular Cancer，HCC）等一系列肝脏病变，其病死率高，已经成为严重影响我国国民健康的公共卫生问题。目前乙型肝炎的发病机制尚未明确，研究清楚发病机制对疾病的治疗对策具有重大意义，因而研究乙型肝炎的发病机制一直是热点问题之一。HBV病毒长期感染，侵犯骨髓造血功能，引起单核-巨噬细胞系统功能减弱，抑制巨核细胞增殖，使血小板生成减少；内毒素的清除能力减弱，导致血小板聚集、激活并损伤^[1]。最近基础免疫研究[2]发现，血小板不仅参与血栓形成，还在炎症反应等固有免疫应答及适应性免疫应答过程中发挥重要的免疫调节作用。固有免疫应答中活化血小板表面表达P-选择素可以促进活化的血小板与多种免疫细胞的粘附，从而造成机体损伤^[3]；应性免疫应答中CD40L是其发挥功能的分子基础，通过CD40-CD40L信号共刺激分子，参与机体的体液免疫和细胞免疫^[4]。近年来临床研究发现肝硬化患者存在门静脉系统和肝脏血管微循环凝血功能亢进，造成门静脉系统血栓形成及微循环障碍，这除了与血管局部血流的异常等有关外，还可能与血小板的异常活化有关^[5]。在正常循环中血小板处于静息状态，当血小板受到生理或病理刺激后，血小板释放胞浆内颗粒膜糖蛋白与质膜融合，使血小板表面糖蛋白发生重排及构象变化而成为活化的血小板。目前,血小板活化及功能的变化在一系列疾病发生发展中的作用越来越被大家重视。当前研究的热点集中在血小板膜各种糖蛋白及受体的变化,如CD40、CD40L和P-选择素。CD40L是由261个氨基酸组成的Ⅱ型跨膜蛋白，主要表达于活化的血小板和T细胞表面。CD40L与其受体CD40结合形成CD40-CD40L共刺激分子，不仅在B细胞和树突状细胞的活化中有重要作用,而且在炎症反应调控、免疫调节等生物学活动中起重要作用^[6]，这些调控作用在冠脉综合症、脑栓塞、2型糖尿病微血管病变的发病机制中起着极其重要的作用[7-8]，已逐渐成为研究的新领域。P-选择素是一种跨膜蛋白，存在于血小板α颗粒和血管内皮细胞Weibel-palade小体内。静息状态下，血小板或内皮细胞表面不表达P-选择素，一旦被激活P-选择素马上表达于血小板和内皮细胞的表面。由于编码基因可选择性不同，P-选择素有两种变型：跨膜P-选择素（CD62P）和可溶性P-选择素（Soluble P-selectin,SP-selectin）。前者是表达于活化的血小板表面，是血小板活化的“金标准”^[9]；而后者存在于血浆或血清中，它是内皮损伤和血小板活化时由部分表达于细胞表面的P-选择素释放到血液中形成的，可反映机体整体的P-选择素水平。因而检测血浆SP-selectin含量可评估血小板活化及内皮损伤程度^[10]。 P-选择素可以通过其凝集素区使血小板与中性粒细胞和单核细胞粘附、聚集，在介导白细胞聚集和氧化损伤起重要作用^[11]。P-选择素还可调节血小板的游走和CD40L的表达，加强与细胞膜上的CD40结合，在介导炎症反应中发挥重要作用^[12]。HBV感染患者常伴有不同程度的凝血机制异常，甚至有出血倾向，这除了与肝细胞损伤有关外，还与血小板和凝血因子的生成减少、消耗增多以及血小板异常活化等因素有关[13]。鉴于以往众多研究慢性乙型肝炎时血小板活化，只限于血小板计数、参数和血小板功能异常等方面，本研究意在从免疫炎症反应层面观察HBV感染时血小板活化膜糖蛋白的变化，探讨乙型肝炎病毒感染后疾病的进展与血小板活化的变化规律，初步阐明HBV感染患者血小板介导肝脏免疫损伤的作用机制。研究目的研究血小板源性CD40L和CD62P﹑血浆SP-selectin﹑血小板聚集率（PAgT）﹑及APRI（AST/PLT）的变化与乙型肝炎病情的发生、发展的关系，阐明乙型肝炎患者外周血血小板的行为特征，为早期诊断和治疗乙型肝炎病情的加重提供实验数据和理论依据。1．检测慢性乙型肝炎、乙肝后肝硬化及原发性肝癌患者血小板CD40L、CD62P的表达，血浆SP-selectin的含量和血小板聚集率（PAgT）的变化及计算APRI值（AST/PLT），分析以上检测因子的变化规律与肝脏病变的关系。2．探讨HBV感染时血小板异常活化的作用机制，为肝病及早采取有效的抗血小板治疗，阻断血小板的活化，对防止乙型肝炎病情的加重有重要的意义。研究方法1．选择研究对象：慢乙肝组32例，乙肝后肝硬化组28例，乙肝后肝癌组30例。所有病例均符合2000年9月西安会议制订的病毒性肝炎防治方案的诊断标准[14]，均根据临床表现、实验室检查和CT或MRI检查确诊，并排除其他肝炎病毒的混合感染或其他自身免疫性疾病。患者入选前均未接受抗病毒治疗或对免疫系统有影响的药物，2周内未服过影响血小板功能的药物。2．采用美国Beckman Coulter公司的流式细胞仪检测血小板CD40L和CD62P的表达情况。3．采用北京普利生仪器有限公司生产的PRECIL LBY-NJ4四通道血小板聚集仪检测PAgT，了解血小板功能水平。4．采用酶联免疫吸附法检测血浆SP-selectin，试剂购自武汉博士德有限公司，严格按说明书进行，了解血浆中血小板的活化程度。5．采用日立7600全自动生化仪检测肝功能指标ALT和AST；采用SIGMA凝血仪检测PT；采用东亚XE-2100全自动血细胞计数仪检测PLT，并计算APRI，即AST与PLT的比值。6．用SPSS17.0软件包进行数据分析，数据资料采用均数±标准差（x±SD）表示，计量资料组间比较采用方差分析，计数资料比较采用t检验，变量相关性采用双变量相关性分析，均以P<0.05（双侧）为有显著性差异。研究结果1．血小板CD40L、CD62P和血浆SP-selectin的表达，在慢乙肝组、肝硬化组和肝癌组均显著高于健康对照组,而且随着病情加重有升高趋势，各疾病组间差异有统计学意义。2．慢乙肝组，肝硬化组及肝癌组PAgT均显著低于健康对照组，而且随着病情的加重，PAgT下降越明显，各疾病组间差异有统计学意义。3．APRI（AST/PLT）值在慢乙肝组、肝硬化组和肝癌组明显高于健康对照组，而且随着乙肝病情加重APRI值逐步升高，各疾病组间差异有统计学意义。4．血小板CD40L和血浆SP-selectin分别与血小板CD62P作相关性分析，发现血小板CD40L和血浆SP-selectin水平的增高均与血小板CD62P的升高呈正相关。5．乙型肝炎患者血小板CD40L、CD62P和血浆SP-selectin分别与肝功能指标及APRI进行相关性分析，发现血小板CD40L、CD62P和血浆SP-selectin的增高与肝功能指标ALT、AST及APRI的升高呈正相关。结论1．HBV感染后血小板CD40L、CD62P及血浆SP-selectin明显增高，血小板聚集率PAgT随病情发展明显下降，提示肝癌、慢性乙肝和肝硬化患者体内有大量的血小板和内皮细胞活化或破坏。2．随着乙肝病情加重APRI（AST/PLT）值逐步升高，提示APRI值在一定程度上可反映慢性乙型肝炎的病情轻重程度，可能作为慢性乙型肝炎病情发展的非创伤性间接评价指标之一。3．HBV感染后患者血小板CD40L、CD62P及血浆SP-selectin的增高与肝功能损害程度呈正相关，检测血小板活化标志物的水平可能成为肝病临床分期与严重程度判断的重要标志之一。