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肺癌居癌症死亡首位,近年来肺癌的发病率在全球范围内仍呈持续上升的趋势,而这一趋势在中国尤其明显。明确其发生、发展机制和开发出有效的治疗方法对医学发展和人类健康越来越重要。本研究对临床肺癌病人血浆及胸腔积液中溶血磷脂酸(LPA)浓度进行检测,明确LPA在肺癌病人中的表达情况。以人肺腺癌Calu-3细胞为研究对象,观察LPA对肺腺癌Calu-3细胞的增殖、迁移及CFTR离子通道的影响,并探讨了其作用机制,为肺癌的治疗提供实验数据和理论依据。本实验首先,采用ELISA(LPA)试剂盒检测肺癌、肺炎及结核性胸膜炎病人血浆及胸腔积液中LPA的浓度,结果发现:肺癌患者血浆及胸腔积液中LPA浓度较肺炎和结核性胸膜炎病人血浆及胸腔积液中LPA浓度显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。采用CCK8实验检测LPA对Calu-3细胞增殖能力的影响,通过划痕实验检测LPA对Calu-3细胞迁移能力的影响,流式细胞仪检测LPA对肺腺癌Calu-3细胞周期的变化,实验结果显示:LPA能够促进Calu-3细胞的增殖和迁移,并增加细胞周期过程中S期的细胞数量。为进一步观察LPA对Calu-3细胞增殖和迁移的影响,我们采用荧光定量PCR技术观察了LPA对细胞增殖、迁移和凋亡相关基因:VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc、Cyclin D1、CDK2、p53的影响。实验结果显示:随着LPA浓度的增加,Calu-3细胞中VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc和Cyclin D1、CDK2的m RNA表达显著增加,而p53 m RNA表达水平显著下降。LPA通过与细胞表面的G蛋白偶联受体结合发挥其作用。G蛋白大致分为Gs、Gi和Gq家族,百日咳毒素(PTX)是Gi蛋白的特异性阻断剂,本研究在Calu-3细胞中加入PTX后发现:VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc和Cyclin D1、CDK2的m RNA表达未见增加,p53 m RNA表达亦未见下降。此外,我们还采用Western blot技术检测了Calu-3细胞中细胞增殖和转移相关蛋白VEGF、HIF-1ɑ、PCNA、c-myc、Cyclin D1、CDK2、p53的变化。实验结果显示:LPA能够上调Calu-3细胞中VEGF、HIF-1α、PCNA、c-myc、Cyclin D1和CDK2蛋白的表达,下调p53蛋白表达,从蛋白水平上进一步说明LPA能够促进Calu-3细胞的增殖和迁移。有研究报道,CFTR离子通道在抑制肿瘤细胞增殖方面有一定作用,我们通过免疫荧光和激光共聚焦显微镜实验观察到在肺腺癌Calu-3细胞膜上存在CFTR蛋白表达,因此采用全细胞膜片钳技术观察了不同浓度LPA对Calu-3细胞膜CFTR离子通道电流的影响。结果发现:5、10、20μmol/L的LPA作用于Calu-3细胞后,CFTR离子通道电流较LPA未处理组具有不同程度的降低。以上结果表明,LPA能够减小Calu-3细胞的CFTR通道电流,这可能是LPA促进Calu-3细胞增殖的机制之一。为进一步研究LPA对Calu-3细胞膜上的CFTR离子通道的影响,我们采用细胞免疫荧光、Western blot的方法检测了LPA对细胞膜上CFTR蛋白表达的影响,结果发现:外源给与LPA能够降低细胞膜上CFTR蛋白的表达,这与我们之前检测到的LPA减小Calu-3细胞膜上的CFTR通道电流结果相一致。本研究还发现Gi蛋白阻断剂PTX能够抑制Calu-3细胞中LPA引起的CFTR电流减小,证实Gi蛋白参与了LPA作用于Calu-3细胞的过程。我们采用免疫荧光法、Western blot的方法检测了细胞膜上LPA受体LPA2的表达,结果发现:Calu-3细胞存在LPA2蛋白的表达,而LPA2是Gi蛋白家族中最主要的膜蛋白之一,这就提示LPA通过作用于细胞膜上的LPA2受体发挥作用,进一步证明:LPA通过作用于细胞膜上的LPA2受体,进而促进肺腺癌细胞Calu3增殖、迁移和侵袭。本研究首先明确了肺癌患者血浆及胸腔积液中LPA浓度明显高于肺炎和结核性胸膜炎患者,说明LPA与肺癌有着密切的关系。同时从体外实验证明LPA能促进肺癌Calu-3细胞的增殖和迁移,增加细胞周期过程中S期的细胞数量。并证明了LPA能够增加促进细胞增殖和转移相关基因和蛋白的表达,降低凋亡相关基因的表达。而且利用膜片钳技术与Western blot证实了LPA能减小Calu-3细胞的CFTR通道电流、降低细胞膜上CFTR蛋白的表达。我们的研究结果提示LPA在肺腺癌的发生及发展中发挥重要作用,为肺癌的靶向治疗提供了新的思路及理论依据