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目的:1.体外研究明确左归丸促小鼠BMSCs增殖和成骨分化的作用并探讨Foxj1调控BMP/Smad信号通路在左归丸促进BMSCs成骨分化的作用机制;2.体内研究探讨Foxj1调控BMP/Smad通路在左归丸治疗小鼠骨质疏松的作用;方法:1.细胞实验研究(1)左归丸调控FoxJ1/BMP/Smad信号轴促小鼠BMSCs成骨分化取8周龄小鼠分离培养BMSCs,观察细胞形态,流式细胞术检测BMSCs表面标记CD29、CD44、Sca-1和CD117;CCK8法检测不同浓度左归丸在1d、2d、3d、5d 7d对小鼠BMSCs的增殖作用,筛选最佳浓度;实验分组:对照组(CON组)、成骨诱导组(OI组)、左归丸组(ZGW组)、左归丸+成骨诱导组(ZGW+OI组),成骨诱导液诱导BMSCs成骨分化,ALP染色检测BMSCs成骨能力,茜素红染色检测骨矿化;荧光定量PCR检测小鼠BMSCs成骨相关指标碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)、Runt相关转录因子2(Runx2)以及成骨相关转录因子(Osx)以及叉头盒J1(FoxJ1)mRNA的表达,Western-blot 检测 FoxJ1、骨形成蛋白 2(BMP2)、Smad1 和 p-Smad1/5 蛋白的表达;(2)左归丸通过FoxJ1调控BMP/Smad通路促进BMSCs成骨分化采用siRNA转染(1)中的小鼠BMSCs,实验分组:空载体(siCtrl)组、FoxJ1转染(siFoxJ1)组,ZGW+siCtrl 组、ZGW+siFoxJ1 组,荧光定量 PCR 检测 FoxJ1 mRNA的表达,Western-blot检测FoxJ1蛋白的表达;对上述分组成骨诱导,ALP染色检测成骨分化能力,茜素红染色检测骨矿化,Western-blot检测BMP/Smad通路相关蛋白的表达。2.动物实验研究(1)骨质疏松模型的构建以及对FoxJ1表达的影响6周龄雌鼠采用去卵巢术构建小鼠骨质疏松模型,micro-CT检测椎体骨微细结构,HE染色检测椎体骨组织形态学,western-blot检测FoxJ1蛋白的表达(2)左归丸通过FoxJ1调控BMP/Smad通路抗骨质疏松的作用上述去卵巢小鼠SiRNA尾静脉注射,左归丸灌胃,实验分组:siCtrl组,siFoxJ1组,ZGW+siCtrl组,ZGW+siFoxJ1组;micro-CT检测椎体骨微细结构,HE染色检测椎体骨组织形态学,western-blot检测FoxJ1、BMP2、Smad1和p-Smad 1/5蛋白的表达。结果:1.细胞实验研究(1)左归丸调控FoxJ1/BMP/Smad信号轴促小鼠BMSCs成骨分化①BMSCs呈梭形,旋涡状生长,流式细胞术结果显示,CD29阳性率98.1%,CD44阳性率98.6%,Sca-1阳性率97.3%,CD117阳性率8.5%;CCK8检测结果采用两因素重复测量方差分析,表明不同浓度左归丸干预不同时间对细胞增殖均存在显著差异,且不同浓度左归丸对细胞增殖的影响随着时间的变化而变化,存在交互作用,以10 μg/ml左归丸干预5天对促进细胞增殖的作用最显著;ALP染色结果显示:ALP染色效果随着成骨诱导时间的增加而增加,从整体观看,在成骨诱导第7天和第14天,OI组培养皿颜色明显深于CON组,在第14天,0I组能看到明显的紫色细胞团;从镜下看,与CON组比较,OI组ALP染色细胞明显增多,颜色加深;从整体观看在成骨诱导第7天和第14天,ZGW组与CON组没有明显颜色差异,但是从镜下看,ZGW组染色细胞明显多于CON组,且颜色较深;与OI组比较,从整体观看,成骨诱导第7天ZGW+OI组与单纯OI组没有明显颜色差异,而成骨诱导第14天,与0I组相比,ZGW+OI组ALP染色细胞明显增多,颜色加深;从镜下看,在成骨诱导第7天和第14天,与OI组相比,ZGW+OI组ALP染色细胞均明显增多,且颜色加深。茜素红染色结果显示:在成骨诱导第7天,与CON组比较,从整体观看,OI组细胞红染范围明显较大,从镜下看,OI组茜素红染色明显加深,且染色细胞数量增多;与CON组比较,ZGW组在整体观和镜下观均没有明显变化;与0I组比较,从整体观看,ZGW+OI组染色程度没有明显变化,从镜下看,ZGW+OI组茜素红染色颜色较深,染色细胞数增多;在成骨诱导第14天,与CON组比较,从整体观看,OI组茜素红染色明显加深,并能看到明显的矿化结节;从镜下看,OI组矿化结节增多,颜色红染加深,染色细胞数量增多;与CON组比较,ZGW组在整体观没有明显变化,在镜下观,ZGW组染色细胞数量增多,染色程度加深;与OI组比较,从整体观看,ZGW+OI组染色范围明显增大,从镜下看,ZGW+OI组染色数量增多,染色程度加深。荧光定量PCR结果显示,与CON组比较,OI组成骨相关基因ALP、OCN、Runx2和Osx mRNA表达均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01);ZGW 组 Runx2 和 Osx mRNA 表达均明显升高(P<0.01,P<0.05);与 OI 组比较,ZGW+OI组ALP、OCN、Runx2 mRNA的表达均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01),ZGW+OI组Osx mRNA的表达与OI组相比无统计学差异,但是存在上升的趋势。②荧光定量PCR结果显示,在成骨诱导1d、3d、7d,OI组FoxJ1 mRNA的表达均低于CON组,差异具有统计学意义(P<0.01);ZGW组在1d和3d是FoxJ1 mRNA的表达显著低于CON组,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05),在成骨诱导第7天,与CON组比较,ZGW组FoxJ1 mRNA的表达没有明显差异,但仍有下降的趋势;与OI组比,ZGW+OI组FoxJ1 mRNA的表达在干预第7天显著降低(P<0.01),在干预第1天和第3天,FoxJ1 mRNA的下降量虽无统计学差异,但仍有下降的趋势。Western blot结果显示:与CON组比较,OI和ZGW组FoxJ1蛋白的表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与OI组比较,ZGW+OI组FoxJ1蛋白的表达明显降低,差异具有统计学差异(P<0.01)。与CON组比较,OI和ZGW组BMP2蛋白的表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01),p-Smad1/5/Smad1显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与0I组比较,ZGW+OI组BMP2蛋白的表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01),p-Smad1/5/Smad1显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。(2)SiRNA转染BMSCs后,荧光定量PCR显示:与siCtrl组相比,siFoxJl组中FoxJ1 mRNA的表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01);与siFoxJ1组比较,ZGW+siFoxJ1组中FoxJ1 mRNA的表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。Western-blot显示与siCtrl组相比,siFoxJ1和ZGW+siCtrl组中FoxJ1蛋白的表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01);与siFoxJ1组比较,ZGW+siFoxJ1组中FoxJ1蛋白的表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。ALP染色结果显示在成骨诱导第7天,从整体观看,与siCtrl组比较,siFoxJ1组培养皿颜色明显较深,染色范围增大;从镜下看,与siCtrl组比较,siFoxJ1组ALP染色细胞明显增多,颜色加深;从整体观看,ZGW+siCtrl组与siCtrl组没有明显颜色差异,但是从镜下看,ZGW+siCtrl组ALP染色颜色较深;与siFoxJl组比较,从整体观看,ZGW+siFoxJ1组与siFoxJ1组没有明显颜色差异,从镜下看,ZGW+siFoxJ1组ALP染色颜色明显加深。茜素红结果显示在成骨诱导第14天,与siCtr1组比较,从整体观看,siFoxJ1组细胞红染颜色明显加深,从镜下看,siFoxJ1组茜素红染色更明显,且染色细胞数量增多;与siCtrl组比较,ZGW+siCtrl组在整体观下没有明显变化,在镜下看,ZGW+siCtrl组矿化结节明显增多;与siFoxJ1组比较,从整体观看,ZGW+si FoxJ1组红染范围明显增大,且颜色较深,从镜下看,ZGW+siFoxJ1组茜素红染色颜色较深,染色细胞数增多,矿化结节增多范围增大。Western-blot结果显示与si Ctr1组比较,siFoxJl和ZGW+siCtrl组BMP2蛋白表达、p-Smad1/5/Smad1均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05),Smad1总蛋白的表达未见明显变化;与siFoxJ1组比较,ZGW+siFoxJ1组BMP2蛋白的表达和p-Smad1/5/Smad均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)2.动物实验研究(1)骨质疏松模型的构建以及对FoxJ1表达的影响MicroCT结果显示,与假手术(Sham)组比较,去卵巢(OVX)组骨微细结构参数BV/TV(%)、Tb.N(mm)、Tb.th(mm)和Tb.sp(mm)均明显下降,差异具有统计学差异(P<0.01):此外,三维重建图显示与Sham组相比,OVX组骨小梁稀疏,不连续,骨小梁数量明显减少,宽度变窄,骨小梁与骨小梁之间间隙变宽。在4倍镜和10倍镜下可见,与Sham组比较,OVX组骨小梁损毁严重,发生断裂,不连续,骨小梁变窄,间隙变宽,骨小梁数量明显减少;20倍镜下可见,与Sham组比较,OVX组可见破骨细胞明显增多,可见明显骨缺损;Western-blot结果显示与Sham组比较,OVX组FoxJ1蛋白的表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)左归丸通过FoxJ1调控BMP/Smad通路抗骨质疏松的作用MicroCT结果显示与siCtrl组比较,siFoxJ1和ZGW+siCtrl组BV/TV明显升高,Tb.sp明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01),Tb.N和Tb.th虽无统计学差异,但是有上升的趋势;与siFoxJ1组比较,ZGW+siFoxJ1组BV/TV、Tb.sp均明显升高(P<0.01,P<0.05),Tb.N和Tb.th虽无统计学差异,但是有上升的趋势。三维重建图显示与siCtrl组相比,siFoxJ1组骨小梁变得密集,连续,骨小梁数量增加,骨小梁与骨小梁之间间隙变窄;ZGW+siCtrl组骨小梁连续性较好;与siFoxJ1组比较,ZGW+siFoxJ1组骨小梁数量增加,骨小梁间间隙变窄。HE染色结果显示,siCtrl组骨小梁断裂,排列不规则,骨小梁数量减少;与siCtrl组相比,siFoxJ1组骨小梁排列有所改善,整齐连续,ZGW+siCtrl组骨小梁排列整齐,骨小梁数量增多;与siFoxJ1组比较,ZGW+siFoxJ.1组骨小梁稍变宽,其余未见明显改善。Western-blot结果显示与siCtrl组比较,siFoxJl组和ZGW+siCtrl组FoxJ1蛋白表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01),BMP2蛋白表达和p-Smad1/5/Smad1明显上升,差异具有统计学意义(P<0.01、P<0.05);与siFoxJ1组比较,FoxJ1蛋白表达、BMP2蛋白表达和p-Smad1/5/Smad1虽有改变趋势,但均无统计学差异。结论:1、体外研究证实沉默FoxJ1能促进小鼠BMSCs成骨分化;左归丸通过抑制FoxJ1激活BMP/Smad信号通路,促进小鼠BMSCs成骨分化;2、体内研究证实高表达FoxJ1是导致去卵巢小鼠骨微细结构和骨组织形态学损害的重要机制;而左归丸通过制FoxJ1激活BMP/Smad信号通路,改善小鼠骨质疏松。