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无乳链球菌是革兰氏阳性细菌,属于B族链球菌(Group B Streptococcus,GBS),是引起我国南方地区罗非鱼链球菌病的主要病原菌之一。近年来,罗非鱼链球菌病频繁发生,使我国水产养殖业遭受了巨大的经济损失,因此,对无乳链球菌的防治和研究迫在眉睫。研究表明,无乳链球菌的毒力受到温度的调控,在水温超过35℃时能引起罗非鱼链球菌病的暴发和流行。为了研究筛选鱼源无乳链球菌毒力相关基因,以不同温度(25℃和37℃)下培养的无乳链球菌ZQ0910为研究对象,将该菌在25℃和37℃下分别培养至对数生长期,然后对这两个样品进行转录组测序。通过对转录组数据分析筛选无乳链球菌毒力相关基因和预测sRNA;并通过荧光定量PCR技术对筛选得到的毒力相关基因的表达水平进行验证;利用RT-PCR方法对预测的部分sRNA进行验证。其结果为研究鱼源无乳链球菌的毒力基因功能及sRNA的调控机制提供了重要线索。具体研究内容如下:1.将25℃和37℃下分别培养的无乳链球菌样本进行转录组测序分析,结果表明37℃样本(Test)基因表达总数为1929条,25℃样本(CK)基因表达总数是1935条。样品间表达显著差异基因总数为673条,显著上调差异基因146条,显著下调差异基因527条。Pathway富集分析表明,1215条基因注释到KEGG的105条通路上,包含447个显著性差异基因;其中显著富集通路有40条,差异最显著的通路包括代谢相关的通路、生物合成相关通路、修复相关通路和信号通路等。2.从无乳链球菌转录组中筛选到7个毒力相关基因,即cylI、cylA、cylK、cyl J、cylG、sodA和PI-2b。首先,对7个毒力相关基因克隆并进行生物信息分析,然后,利用荧光定量PCR进行验证。结果显示:7个毒力相关基因都能够克隆到全长;7个基因的荧光定量结果与转录组测序结果的表达趋势一致,只是相对表达量的倍数有所差异。总的来说,转录组结果的可靠性较高。3.从无乳链球菌转录组中预测到sRNA 167条,对部分预测的sRNA应用RT-PCR进行验证。结果显示:SAR-1、SAR-9、SAR-4、SAR-14、SAR-T克隆获得的片段长度分别是178bp、139bp、110bp、165bp、111bp,而且,克隆获得的基因片段都能够完全比对到各自预测的sRNA序列上。说明这几个sRNA存在于无乳链球菌ZQ0910。