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刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）是一种重要的细胞外寄生虫，可以感染几乎所有海水硬骨鱼类。由于其地理分布广、宿主范围广和繁殖速度快等特点，每年给海水鱼类养殖业造成重大经济损失。石斑鱼因其肉质鲜美、营养丰富等优点，成为我国沿海地区主要海水养殖品种，但刺激隐核虫病严重威胁到石斑鱼养殖业的健康发展。广泛开展石斑鱼免疫研究，不但能揭示宿主抗刺激隐核虫病的免疫应答机制，还对该寄生虫病的免疫防治提供理论指导。本论文首次克隆了斜带石斑鱼5种Toll-like receptor （TLR）（2种全长序列，3种EST序列）和1种TLR信号通路接头蛋白（MyD88）cDNA序列，分析了全长序列的蛋白结构及组织表达模式；在此基础上结合NCBI上已报道的石斑鱼免疫相关基因序列，通过Real-time PCR检测了刺激隐核虫感染后这些基因的表达谱；重组表达了TLR9、TLR21和MyD88融合蛋白，制备了抗融合蛋白多克隆抗体；最后，通过荧光素酶报告基因试验检测了TLR9-TIR、TLR21-TIR和MyD88在HEK293T细胞中的信号激活能力，取得的主要结果如下：1.本论文扩增得到了斜带石斑鱼TLR21、TLR3和MyD883个基因的cDNA全长序列。蛋白结构分析和生物信息学分析显示（1）TLR21ORF全长2937bp（由1个外显子编码），推测编码979个氨基酸残基。该蛋白含有1个N端富含半胱氨酸的cap，27个富含亮氨酸重复序列的LRR基序，1个C端富含半胱氨酸的cap和1个胞内的TIR结构域。其中N端cap有2个半胱氨酸，C端cap有4个半胱氨酸。TLR21蛋白共含有16个N-糖基化位点。（2）TLR3ORF全长2730bp，编码909个氨基酸残基。该蛋白含有1个N端cap，25个LRR基序，1个C端cap和1个胞内的TIR结构域。其中N端cap有3个半胱氨酸，C端cap有4个半胱氨酸。（3）MyD88ORF全长873bp （由5个外显子编码），编码291个氨基酸残基，具有保守的DD结构域和TIR结构域。MyD88-TIR结构域的3D模型显示，该结构域是由6个α-helix包裹着5条平行的β-sheet构成的球状结构，5个参与信号转导的保守的氨基酸残基(Arg189、Asp190、Lys210、Gln275和Arg281)位于球形表面。同源比对表明TLR21、TLR3和MyD88的TIR结构域较其它结构域（如LRR结构域和DD结构域）更为保守，进化分析显示这3种蛋白与鱼类同源蛋白亲缘关系更近，进化树上归为一支。此外，我们还扩增了石斑鱼TLR2、TLR9和TLR223个基因部分cDNA序列，NCBI Blast在线比对表明这3个cDNA片段为相应TLR的同源物。组织表达分析显示：TLR21、TLR3、MyD88和TLR22mRNA在检测的组织中广泛表达，但不同基因的组织表达模式存在差异。TLRs mRNA在脾脏和体肾中表达量较高，但MyD88mRNA在除皮肤和肌肉外的其它检测组织中表达量差异不大。2.通过实时定量PCR检测了刺激隐核虫感染后不同时间点，石斑鱼皮肤、鳃、脾脏和头肾中TLR及信号通路基因和其它一些免疫相关基因表达量的变化，结果发现寄生虫感染后：（1）石斑鱼TLR9和TLR21的表达量在皮肤和鳃中主要呈上调趋势，感染早期TLR9在脾脏中表达量也出现上调；而TLR2则在脾脏和头肾中表达量显著增加，而在局部病原感染部位降低。TLR3和TLR22两个基因表达规律性不强，只是在某些时间点升高或降低。接头蛋白MyD88表达量并没有呈现感染位点和系统免疫位点的差异，因为该蛋白是除TLR3之外的所有TLR及IL-1受体共用接头蛋白，所以其表达可能受到多方面的调节；（2）寄生虫感染可以诱导本研究中6个非特异性免疫相关基因表达量的变化，其中C-type lectin和IL-1β在感染后的几乎所有位点都呈上调趋势；而COX-2在感染后的脾脏（感染早期）和头肾中几乎无表达；（3）特异性免疫细胞Marker基因表达有部分上调，其中IgM在感染后期的皮肤、鳃和头肾上调量显著。另外，刺激隐核虫感染可引起鳃局部炎症反应，严重时可导致鳃丝脱落或融合，寄生虫寄生部位出现大量免疫细胞迁移或增殖现象。综上所述，刺激隐核虫感染能调节石斑鱼局部粘膜组织和系统免疫组织TLRs及其它免疫相关基因表达量的变化，这些变化可能是由局部免疫细胞的增殖或迁移引起的。3.利用大肠杆菌表达系统表达了石斑鱼TLR21和TLR9部分LRR结构域及MyD88全长序列，可溶性分析发现此3种融合蛋白都是以包涵体形式表达。经尿素梯度洗涤后，用8M尿素溶解。SDS-PAGE后割胶回收目的蛋白，免疫小鼠制备抗融合蛋白的多克隆抗体。Western blot显示该多抗能特异性识别融合蛋白，为进一步标记石斑鱼天然TLR及其接头蛋白奠定基础。4.构建了石斑鱼TLR21-TIR结构域、TLR9-TIR结构域和MyD88全长序列pFLAG-CMV2/pcDNA3.1表达载体，转染HEK293T细胞24h后发现：TLR9-TIR结构域和TLR21-TIR结构域表达细胞抑制了NF-κB活性，而TLR9-TIR结构域表达细胞却能激活IFN-β启动子；MyD88可以激活293T细胞NF-κB和IFN-β活性，且随着转染量增加，对这两种信号通路的激活能力增强，且对NF-κB活性的增强作用更为明显。pEGFP-N1-MyD88定位载体转染293T细胞后，发现MyD88定位于细胞质特定位置。