生物大分子药物由于具有高度的特异性,因此在有效性和安全性上拥有其他种类药物不可比拟的优势,广泛应用于治疗肿瘤,自身免疫性疾病等重大疾病领域。生物药的高级结构(即空间结构)对于实现其生物医学治疗功能至关重要,任何涉及到高级结构的改变都可能对生物药的安全性、有效性及药代特征产生影响,这一点是生物药物开发和质量控制上与小分子化药的一个重要区别。目前蛋白质高级结构表征的方法主要有X-射线晶体衍射(XRD)、核磁共振光谱(NMR)、冷冻电镜(cryo-EM)、圆二色光谱(CD)、质谱的氢氘交换法(HDX)等。其中XRD具有极高分辨率,可以提供更精细的高级结构信息,但因大多数蛋白质不易结晶而无法广泛利用,并且XRD测得的结果是基于晶体的固相结构,无法准确反映蛋白质在液相中的结构。CD的优点是检测快速简便,缺点是分辨率低,仅能够提供二级结构的信息。HDX可以提供特异性位点的高级结构信息,但由于实验精密度差,应用并不广泛。与以上高级结构表征方法相比,核磁共振(NMR)技术具有高分辨率,可在原子尺度上表征更接近生理状态的溶液状态下的蛋白质高级结构,能够提供包括精细三维结构,动态结构以及配体与靶细胞结合等诸多蛋白质的结构信息。然而目前NMR在单抗药物上的应用却还十分有限,这与NMR在其他药物研究中发挥的重大作用形成显著的反差。其中一个重要原因是单抗的全同位素标记在药品研发和生产过程中难以实现,从而导致NMR信号化学位移指认困难,因此无法通过NMR来获得蛋白质位点特异性的结构信息。针对这个问题,本论文拟研究一种借助液质联用技术(LC-MS)对于蛋白质NMR信号进行指认的新方法。这一方法不需要依赖同位素标记的样品,只需要自然丰度的蛋白样品。该方法是利用结构质谱学上的氨基酸的专属性修饰和溶剂可及性的原理,首先对蛋白质中的目标氨基酸进行选择性化学修饰,由于溶剂可及性的不同,不同位点上的目标氨基酸修饰反应速率之间会有差异,通过二维NMR与LC-MS技术测量各位点目标氨基酸的修饰反应速率。因为LC-MS是在肽段水平上测量目标氨基酸的修饰速率,本身就包含氨基酸的位点信息,因此,最终通过NMR与LC-MS测得的修饰速率的比对就能将NMR信号与目标氨基酸的位点对应起来,从而获得NMR信号的指认。鉴于精氨酸在各种生物过程中发挥的必不可少的重要作用,以及明确的精氨酸侧链NMR信号解析对于表征蛋白高级结构、蛋白质间相互作用和动力学研究所具有的重要意义,本论文以精氨酸为研究对象,使用模型蛋白——泛素,建立了这种借助LC-MS对于自然丰度的蛋白质的精氨酸侧链NMR信号指认的新方法。根据LC-MS和NMR测得的精氨酸修饰速率的排序比对,获得三个精氨酸NMR信号的归属,即信号A,B,C分别对应的是R54ε-NH,R72ε-NH,R42ε-NH。在方法建立的基础上,进一步探索新方法在以降钙素基因相关肽(CGRP)抗体为代表的抗体药物识别抗原表位研究中的应用。通过抗体对抗原NMR信号的扰动,并结合ELISA方法分析抗体与各段肽的交叉反应性,研究了新抗体CGRP-BOAN-Ig G2与对照抗体的抗原表位,并对抗原表位上的精氨酸NMR信号进行了指认。结果表明,新抗体与对照抗体的表位均位于CGRP的25-37段,C端酰胺是两种抗体结合必不可少的区域,同时,精氨酸R11和R18也属于对照抗体抗原表位的一部分,但不属于新抗体抗原表位的一部分;通过修饰速率的直接排序比对获得两个精氨酸NMR信号的归属,即信号A,B分别对应的是R11ε-NH和R18ε-NH。明确新抗体结合抗原上的具体位置,并准确归属表位上的精氨酸,对于新抗体的开发和特性鉴定具有重要意义。综上,本研究针对目前NMR技术在单抗药物高级结构表征上应用的瓶颈,即自然丰度下蛋白质NMR信号的指认问题,提出了一个全新的将MS和NMR技术相结合的方法,并创新地利用化学修饰对于NMR信号进行指认。本研究可为其他不易同位素标记的蛋白质的NMR信号指认提供有意义的参考,进一步推动MS和NMR技术在蛋白质高级结构和蛋白质间相互作用的应用,并进一步拓展NMR的应用到生物药研究中。