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目的:本研究利用乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)在Wistar大鼠E10天对其胎鼠行灌胃致畸,建立ARMs(Anorectal Malformations,ARMs)动物模型,运用免疫组化(Immunohistochemical-paraffin section,IHC-P),Western blot及q RT-PCR技术,对ARMs胎鼠和ARMs胎鼠肛门直肠发育过程中Pax1及Pax3基因在直肠末端表达水平进行检测,探讨ARMs发生与Pax1及Pax3基因的相关性。实验材料:1、实验动物:体重220~250gWistar雌性大鼠,体重250~300gWistar雄鼠(均购自中国辽宁长生生物技术有限公司)。2、实验试剂:乙烯硫脲,Ethylenethiourea,ETU(纯度99%)(购于德国Aldrich公司),Pax1AB203065)、Pax3(AB180754)多克隆抗体(Abcam公司);免疫组化试剂盒和DAB显色剂(均购于福州迈新生物技术开发有限公司);GAPDH抗体(Proteintech TM公司);蛋白提取试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所);逆转录试剂盒(TAKARA biotechnology Co/大连宝生物工程有限公司)。实验方法:Wistar孕鼠E10(Embryonic day 10,妊娠第10天),经胃管给予125mg/kg浓度为1%的ETU(生理盐水做溶剂),制作ARMs大鼠动物模型,对照组均给予等量的生理盐水。于大鼠E14-E17天剖宫取胎,辨别畸形后分为ARMs组和正常组。将胚胎置于解剖显微镜下用显微器械无菌条件取直肠末端置于高压后EP管中并于-80℃深冻冷藏,以备q RT-PCR及Western blot实验之用。部分标本置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定24-36h后常规脱水,石蜡包埋,制成蜡块,择期进行矢状面切片,备免疫组化。分别进行下列实验:(1)免疫组化-石蜡切片(IHC-P),观察ARMs及正常大鼠胚胎肛门直肠发育情况,以及Pax1、Pax3基因在两组胚胎末端直肠肛门的表达情况。(2)显微镜下取材获得的直肠末端组织,一部分行Pax1、Pax3的Western blot实验进行蛋白定量分析,其结果经Proto Blot II AP分析系统扫描对蛋白质含量进行密度分析,用相对灰度值代表指标蛋白表达量。部分组织进行Pax1、Pax3的q RT-PCR,探索其在两组胚胎直肠末端m RNA的表达情况。数据以均值±标准差表示,采用IBM SPSS Statistics 21软件进行t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。实验结果:免疫组化结果:ETU致畸的ARMs胚胎表现为尿直肠膈未与泄殖腔膜融合,直肠和泌尿生殖道存在共同通道,形成瘘道,或形成永久泄殖腔。Pax1、Pax3在正常和ARMs大鼠胚胎直肠末端发育过程中均有表达。Pax1正常组:在胚胎发育过程中,表达强度出现变化,E14、E15表达明显。ARMs组:E16-E17表达较正常组增强,其中E16差异尤为显著。Western blot和q RT-PCR结果显示正常组胎鼠直肠末端组织中Pax1蛋白和m RNA E14表达明显高于ARMs(P<0.05):E15、E16、E17差异明显与免疫组化结果趋势一致。Pax3正常组:在胚胎发育过程中,表达强度出现变化,E14、E17表达相对明显;ARMs组:E14-E17表达较正常组增强差异明显,其中E14、E17差异尤为显著。q RT-PCR结果显示ARMs胎鼠直肠末端组织中PAX3蛋白和m RNA E14、E17表达明显高于正常组(P<0.05):E16、E15差异明显与免疫组化结果趋势一致。结论:(1)Pax1、Pax3在胎鼠泄殖腔分化、肛门直肠形成时期有表达,且存在时空表达的不平衡,认为两者可能在大鼠胚胎期泄殖腔和直肠发育过程中起作用;(2)Pax1在E14、E15正常组大鼠胚胎期泄殖腔和直肠的表达较畸形组大鼠胚胎期增强;E16、E17正常组大鼠胚胎表达较畸形组减弱,提示Pax1基因表达的减弱可能与ARMs的发生相关。(3)Pax3在畸形组大鼠胚胎期泄殖腔和直肠的表达较正常组大鼠胚胎期增强,提示Pax3基因表达的增高可能与ARMs的发生相关。