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研究目的肺癌的高发病率和高死亡率使其成为威胁人类健康的主要疾病,其中约85%的肺癌是非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)。吡咯啉-5-羧酸还原酶1(Pyrroline-5-carboxylate reductase 1,PYCR1)参与脯氨酸代谢,催化吡咯啉-5-羧酸还原为脯氨酸,脯氨酸的代谢在肿瘤的发生中非常重要。前人的研究发现,PYCR1在多种恶性肿瘤中呈现高表达,在前列腺癌细胞中敲除PYCR1能够显著抑制细胞生长和克隆形成,抑制PYCR1表达的乳腺癌细胞的侵袭性减弱,在食管鳞癌中与PYCR1形成的蛋白质复合物可以调控肿瘤细胞的增殖及转移。然而,PYCR1在NSCLC中的功能研究还不多,本研究旨在揭示PYCR1对NSCLC肿瘤学特性的调控及其对上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)信号通路的影响。研究方法1.分析数据库信息得到肺癌中PYCR1的m RNA表达情况,并进一步分析了不同类型肺癌中PYCR1的m RNA表达情况,同时,对PYCR1表达量的高低与患者生存的情况进行分析。通过免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测NSCLC组织及相应癌旁组织中PYCR1的蛋白表达情况。2.通过Western blot检测五种常见NSCLC细胞株中PYCR1的表达情况。设计sh RNA敲减95C及H1299细胞中PYCR1的表达,构建敲减细胞株,然后利用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和Western blot验证敲减效率。3.体外分析PYCR1对NSCLC细胞生物学特性的影响。在稳定敲减PYCR1的95C及H1299细胞株中,应用MTT和细胞克隆形成实验检测细胞的恶性增殖特性,应用细胞划痕实验判断细胞增殖速率及迁移的特性,应用Annexin V/DAPI双染色法结合流式细胞术检测细胞凋亡情况,应用PI染色法检测细胞分裂各个时期分布变化。4.研究PYCR1在NSCLC中起作用的具体机制。检测PYCR1对NSCLC细胞迁移和侵袭的影响,研究PYCR1对肿瘤细胞的原位增殖能力及恶性肿瘤细胞迁移的调控作用。通过Western blot研究EMT信号通路的变化。研究结果1.通过分析数据库信息我们发现PYCR1在肺癌中呈现高表达,并且通过生存曲线分析发现PYCR1高表达是肺癌复发及转移的危险因素,PYCR1高表达会导致患者总生存率下降。通过IHC检测肺腺癌病人的肿瘤标本组织及对应癌旁组织中PYCR1的表达量,验证了PYCR1在NSCLC组织中的表达明显高于癌旁组织这一结论。2.通过Western blot检测NSCLC细胞系中PYCR1的表达情况,我们发现PYCR1在五种常见NSCLC细胞系中均有表达。设计sh RNA进行慢病毒包装并感染95C细胞和H1299细胞,然后利用RT-q PCR及Western blot检测确认95C和H1299中PYCR1的表达被降低。3.在细胞表型实验中,敲减95C、H1299细胞中PYCR1后,MTT实验表明细胞的生长受到明显的抑制;克隆形成实验中细胞克隆形成的面积与克隆数量明显减少;细胞划痕实验显示细胞的迁移速度明显变慢。Annexin V/DAPI双染色法结合流式细胞术检测发现敲减95C细胞中PYCR1后细胞的早期凋亡与晚期凋亡较对照组上升。对细胞进行PI染色后检测发现PYCR1敲减组的G0/G1期下调、G2/M期上调。4.Transwell实验结果表明在95C、H1299细胞中敲减PYCR1后,敲减组细胞的迁移能力及侵袭能力较对照组明显减弱。Western Blot实验表明,在95C、H1299细胞中敲减PYCR1后,钙粘附蛋白(E-cadherin)表达上升,蜗牛蛋白(Snail 1)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达水平出现不同程度的下降。研究结论以上结果显示PYCR1在NSCLC中发挥重要的功能,其在肺腺癌组织中的高表达意味着PYCR1可能是NSCLC形成的致癌基因。PYCR1在癌和癌旁的差异表达也表明PYCR1是肺癌预后生存率过低的危险因素。细胞实验表明,敲减PYCR1后,NSCLC的恶性生物学功能均受到不同程度的抑制,包括细胞增殖能力的减弱、迁移及侵袭能力的降低、克隆形成能力的减弱、细胞凋亡水平的上升以及诱导细胞阻滞在G2/M期。而且PYCR1的缺失会导致EMT形成过程的阻滞从而导致细胞侵袭和转移能力受到抑制。围绕PYCR1及相关信号通路开展深入研究,不仅有望发现用于早期诊断NSCLC的分子标记物,而且可能提出基于PYCR1及其信号通路的治疗新策略,具有重要的理论意义和应用价值。