研究背景系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种临床表现多样,可累及多个系统、多个脏器的自身免疫性疾病。本病好发于青年女性,发病高峰为15-40岁,男女发病比例为1：9左右。全球的患病率约为30-50/10万人,据我国流行病学的初步统计,我国的患病率约为70/10万人-100/10万人,且有逐年增多的趋势。SLE发病机制目前尚未完全阐明,可能与遗传、环境、性激素等因素有关,但B细胞过度活化和自身抗体的产生在SLE发病中起了重要作用,机体产生的这些自身抗体与相应抗原结合形成免疫复合物,免疫复合物沉积于皮肤、血管、肾脏、神经系统等处,进而引起多组织及多器官的损害。SLE的临床表现多种多样：表现有反复高热或长期低热,脱发,关节肿胀疼痛,皮肤可出现面颊部蝴蝶形红斑或盘状红斑,累及口腔粘膜时出现点状出血、糜烂或溃疡等,并且还可侵犯胸膜、心脏、肾脏,对神经系统、血液系统、消化系统等均可造成损害。当累及神经精神系统称之为神经精神狼疮(Neuropsychiatric systemic lupus erythematosus,NPSLE),是SLE病情严重的一种表现,且病死率高。NPSLE临床表现多样,可发生在SLE任何时期,且其发病机制不清楚,但近年来大量学者发现自身抗体可能与NPSLE发病机制相关。但目前国内外对NPSLE诊断标准仍不完善,且缺乏早期预测和诊断NPSLE实验室诊断方法。自身抗体的实验室检测已成为SLE诊断的重要依据之一,抗Sm抗体、抗磷脂抗体、抗核抗体、抗DNA抗体已被纳入1997年美国风湿病协会(American College of Rheumatology, ARA)修订的SLE诊断标准中。但SLE是一种多种自身抗体参与的免疫性疾病,许多新的可能参与SLE甚至NPSLE发病的自身抗体被越来越多的研究者发现。抗Sm抗体是1966年Tan从名为Smith的患者血清中发现的一种SLE标志性抗体,是SLE患者的血清特异性标志,在SLE患者血清中阳性率为21%-30%,其对SLE诊断特异性很高,但敏感性较低。已证实抗Sm抗体的水平与SLE疾病活动程度及临床表现没有相关性,但是,抗Sm抗体的检测对早期、不典型的SLE或治疗后的回顾性诊断具有很大帮助。目前对抗Sm抗体的检测常用的有免疫扩散法(Immunodiffusion ID)、免疫印迹法(Immunoblotting test test, IBT)及免疫电泳法(Counter immune electrophoresis CIE)三种方法,目前医院多以IBT作为抗Sm抗体的主要检测方法。但IBT法对于抗Sm抗体的检测敏感性较高而特异性较低,主要原因在其结果判定时准确性不够,目前多数IBT法以出现28KD、29KD、13.5KD条带作为阳性判断标准,但Sm抗原具有多种异构体成分多肽,抗Sm抗体的不同一性,与不同的Sm抗原决定簇或成分多肽亲和力不同,以不同条带作为抗Sm抗体阳性判断标准将影响IBT法对抗Sm抗体检测的阳性率。抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibody, ACA)是抗磷脂抗体中的一种,可结合于红细胞、血小板和内皮细胞等细胞膜上带负电荷的磷脂,造成红细胞、血小板和内皮细胞等细胞受损,进而导致血栓形成、血小板减少等损害,大量研究证实ACA在动静脉血栓、血小板减少、自发性流产的发生机制中起重要作用。ACA可见于SLE或其他结缔组织病,但以SLE患者中阳性率最高,可达30%-40%,研究发现ACA阳性与SLE患者血小板减少、血栓形成、血管炎以及神经系统病变有关。抗核糖体P蛋白抗体(anti-ribosomal P-protein autoantibody, ARPA)为针对核糖体P蛋白c末端区的抗体,主要针对60s核糖体亚单位磷酸蛋白P0、P1、P2,近年来有大量报道证实抗核糖体P蛋白抗体只存在SLE患者中,为SLE特异性抗体,且对SLE诊断特异性很高,是继抗Sm抗体、抗DNA抗体后发现的另一SLE特异性抗体。早期仅发现ARPA在SLE神经系统病变中发挥重要作用,其与严重抑郁、癫痫、痴呆、横贯性脊髓损伤、无菌性脑膜炎等神经精神性狼疮(NPSLE)临床症状的出现相关,且滴度与精神病、抑郁的严重程度、临床病程相关,现发现ARPA与SLE病情活动度、血小板减少及肾脏损害亦相关,可作为SLE病情活动程度的评价指标。抗N-甲基-D-天冬氨酸受体抗体(抗NMDA受体抗体),是针对NMDA受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor)的一种抗体。NMDA受体是一种中枢谷氨酸盐兴奋性受体,其在整个脑神经细胞都有表达,并对于神经突触形成、神经元发育、神经细胞移行等发挥重要作用,且影响学习和记忆等多种生理过程。抗NMDA受体抗体透过血脑屏障与NMDA受体结合后,可引起神经元凋亡,进而出现中枢神经系统异常；并可通过与海马神经元的结合,出现记忆、学习等认知功能障碍。已有大量研究证实抗NMDA受体抗体参与NPSLE的发病机制,与NPSLE患者情绪低落、短期记忆学习能力下降、认知功能障碍的临床表现有关。抗神经元抗体(Anti-neuronal antibody, anti-NA)常见为IgG和IgM型,由多种不同抗原成分的抗体组成,大致可分为抗神经细胞膜抗原和抗神经细胞质抗原的抗体。抗神经元抗体可结合于神经细胞,促进分泌细胞因子,继而发生炎症反应,导致广泛的神经组织损伤。有研究者在有神经系统损害的SLE患者血清及脑脊液中发现抗神经元抗体,所以推测抗神经元抗体可能参与NPSLE发生机制中,随着对抗神经元抗体深入研究,没有发现抗神经元核抗体(抗-Hu,抗-Yo,抗-Ri)在NPSLE的发生机制发挥作用,而发现抗神经元抗体(IgG型)与NPSLE的神经精神症状相关。目前对于ACA及ARPA的检测多采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),因其操作简单方便,且可定量检测抗体水平,故广泛应用于临床实验室中。而抗NMDA受体抗体及抗神经元抗体(IgG型)目前尚无成熟的实验室检测方法,一些文献采用体外合成一段肽链作为抗原建立间接ELISA法检测抗NMDA受体抗体,但各研究者使用的阳性对照并不相同,有研究者以预实验中强阳性患者的标本作为阳性对照,有研究者利用单克隆抗体作为阳性对照,前者的实验准确性有所降低,而后者应用于临床实验室中会增加检测费用。对于抗神经元抗体的检测方法有免疫荧光法、免疫放射标记法等,大多数学者采用人神经母细胞瘤瘤系细胞作为抗神经元抗体的来源细胞,免疫荧光法其原理是用荧光抗原标记物检测相应抗体,因其免疫荧光非特异性染色问题尚未完全解决,结果判定客观性不足,并且技术程序比较复杂临床较少使用,而免疫放射标记法也存在不足,其是利用同位素标记抗原从而追踪抗体,故此方法有引起实验者辐射损伤的可能,并且该实验易出现交叉反应、假阳性反应等,也不是临床实验室的首选检测方法。所以对于建立和完善抗NMDA受体抗体及抗神经元抗体(IgG型)实验室检测方法,进一步研究其与NPSLE相关性对于诊断及预防NPSLE具有重要意义。目的1.完善或建立抗NMDA受体抗体及抗神经元抗体(IgG型)实验室检测方法。2.研究SLE患者血清中ACA、ARPA、抗NMDA受体抗体及抗神经元抗体等四种自身抗体的表达水平及其与SLE疾病活动度的关系,进一步评价四种抗体在SLE尤其是NPSLE临床诊断中的应用价值。3.建立免疫扩散法检测SLE患者血清中抗Sm抗体,评价目前临床常用的免疫印迹法检测抗Sm抗体的敏感性和特异性。研究方法1、采用夹心ELISA法试剂盒分析30例SLE患者(包括活动期SLE患者组21例和非活动期SLE患者组9例),30例正常人血清及2例NPSLE患者脑脊液中ACA, ARPA两种抗体的水平。2、以体外合成的肽抗原(Ac-WEYSvwL-SN-NH2)作为抗原建立间接ELISA法检测30例SLE患者(包括活动期SLE患者组21例和非活动期SLE患者组9例),30例正常人血清及2例NPSLE患者脑脊液中抗NMDA受体抗体的水平。3、以人神经上皮瘤细胞株(SK-N-MC)作为抗原建立细胞-ELISA法检测30例SLE患者(包括活动期SLE患者组21例和非活动期SLE患者组9例),30例正常人血清及2例NPSLE患者脑脊液中抗神经元抗体(IgG型)的水平。4、以兔胸腺丙酮粉浸出液作为抗原建立免疫扩散实验,同时用免疫印迹法检测32例SLE患者(包括活动期SLE患者组22例和非活动期SLE患者组10例),30例正常人血清中抗Sm抗体。应用SPSS13.0统计软件,正态分布计量资料采用均数±标准差描述,两样本间的比较采用两样本均数的t检验；当满足方差齐性时,各组均数间的多重比较使用LSD方法进行分析：当不满足方差齐性时使用近似F检验(Welch方法)进行分析,各组均数间的多重比较使用校正的多重比较方法(Dunnett’S T3)进行分析。完全随机设计的两样本率的比较用χ2检验,配对设计的两样本率的比较用McNemar检验,非参数数据的相关分析用Spearman秩相关,一致性检验用Kappa检验。以P<0.05视为有统计学意义。结果1、ACA和ARPA在活动期SLE患者组血清中的表达水平及阳性率均显著高于非活动期SLE患者及正常对照组(P<0.05),且ACA、ARPA与SLE病情活动程度呈正相关(P<0.05),在伴有血小板减少、皮疹、蛋白尿等症状的SLE患者中ACA检出率高,而ARPA仅与SLE患者出现皮疹、蛋白尿临床表现相关；在SLE患者中同时检测ACA和ARPA与单独检测ACA和ARPA对SLE的诊断价值比较无统计学意义(P>0.05)。2、抗NMDA受体抗体及抗神经元抗体在活动期SLE患者血清中的水平均高于在正常对照组(P<0.05),但活动期SLE患者组与非活动期SLE患者组比较无统计学意义(P<0.05),它们与SLE患者血小板减少、皮疹、关节炎、蛋白尿临床表现无关(P>0.05)。3、2例被诊断为NPSLE的患者血清及脑脊液中ARPA、抗NMDA受体抗体及抗神经元抗体均阳性,经有效治疗(1例使用甲基强的松龙1.0g静脉灌注连续治疗3天,1例使用氨甲喋呤5mg+地塞米松5mg鞘内注射治疗)症状缓解病情稳定后,患者血清ARPA仍阳性,但滴度明显降低,而抗NMDA受体抗体及抗神经元抗体均转阴性,相反在脑脊液中三种抗体仍为阳性,但滴度明显降低。4、比较免疫扩散法与免疫印迹法检测SLE患者血清中抗Sm抗体的结果一致性较差(Kappa=0.321),其两者阳性率比较有统计学意义(P<0.05),相比免疫扩散法,免疫印迹法检测抗Sm抗体敏感性更高而特异性较低。结论1、ACA、ARPA、抗NMDA受体抗体及抗神经元抗体均可作为SLE诊断的血清学依据,且ACA、ARPA与SLE病情严重程度相关,可作为判断SLE治疗效果的指标；2.ACA与SLE患者出现血小板减少、皮疹、蛋白尿临床表现相关,ARPA与SLE患者出现皮疹、蛋白尿临床表现相关,抗NMDA受体抗体及抗神经元抗体与SLE患者血小板减少、皮疹、关节炎、蛋白尿临床表现无关；3.2例诊断为NPSLE的患者在有效治疗前后其脑脊液中ARPA、抗NMDA受体抗体及抗神经元抗体均阳性,但治疗后滴度明显下降,而血清中抗NMDA受体抗体及抗神经元抗体在治疗后转阴性。提示检测脑脊液中的ARPA、抗NMDA受体抗体及抗神经元抗体更有助于判断及预测狼疮脑病的发生；4.临床中对诊断证据不足、仅抗Sm抗体阳性的患者,在诊断为SLE时应持谨慎态度,应进一步用免疫扩散法加以证实以避免误诊。