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近年来绵羊呼吸系统疾病日益频发,引起该病的病原非常复杂。肠外致病性大肠杆菌被认为是可以特异性的定植于宿主肠外并引发肠外疾病的主要病因,可以引起新生儿脑膜炎,尿道感染和肺炎等;近年来国内外由肠外致病性大肠杆菌感染引起呼吸系统疾病的报道也越来越多,直接威胁畜牧业生产和公共卫生安全。2016年底新疆生产建设兵团石河子地区周边团场规模场部分羔羊出现咳嗽、喘气、口鼻流涎,呼吸和脉搏加快、体温升高等明显呼吸道症状,最后因呼吸衰竭而亡。为了确定规模场引起羔羊患呼吸道症状的细菌性病原及其病原特性,本研究以病死羔羊为研究对象,采用细菌常规分离鉴定结合16S rRNA序列分析的方法,分离鉴定病原并通过人工感染小鼠和绵羊确定其致病性,同时分析分离株药物敏感性、耐药基因和毒力基因携带情况、生物被膜形成能力以及对小鼠肺泡上皮细胞黏附侵袭能力,为羊源肠外大肠杆菌感染的深入研究提供有用数据。1.绵羊肺源致病性大肠杆菌的分离与鉴定:无菌采集不同时间送检的因呼吸道感染的发病羔羊肺脏组织进行细菌的分离培养,经生化鉴定和16S rRNA测序分析得到10株大肠杆菌（命名为ExPEC XJ-01—XJ-10）,结合小鼠致病性试验和特异性毒力基因检测确定为肠外致病性大肠杆菌。ExPEC XJ-07株引起绵羊肺脏肺泡壁毛细血管充血,界限不清,支气管管腔充血,周围淋巴细胞浸润、增生;半数致死量为109.24CFU/mL,分离株携带ibeA、ibeB、ibeC、iutA、fyuA、ireA、hlyD和afa 8种毒力因子;菌株都呈现多重耐药性,对诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、复方新诺明、阿奇霉素、米诺环素、克林霉素、青霉素、阿莫西林、头孢唑啉、头孢拉定、链霉素、庆大霉素、多西环素、麦迪霉素、氟苯尼考等17种抗生素出现不同程度的耐药,携带有str A、strB、aadA1/aadA2、Bla(TEM1)、Bla(OXA1)、TetA和Tet B 7种耐药基因。2.绵羊肺源致病性大肠杆菌人工感染试验:为了验证分离于绵羊呼吸道感染大肠杆菌对本动物的致病性,本试验选择绵羊肺源致病性大肠杆菌XJ-07株通过滴鼻感染,滴鼻加气管注射,静脉注射,口服和肌肉注射方式人工感染7只2月龄左右健康寒羊羔羊,观察感染羔羊临床症状,定期进行血常规分析,观察动物主要脏器病理变化,同时分离细菌。试验结果显示,最佳感染方式为口服（2×10100 CFU/mL）和肌肉注射（2×109CFU/mL）,这两组羔羊在感染后9 h开始出现轻微腹泻症状,随着时间延长腹泻逐渐消失,感染后16 h出现了以呼吸道感染症状为主要特征病症,表现为咳嗽、喘气、呼吸增速以及鼻腔流出大量分泌物、精神沉郁等;感染羊血液中白细胞总数、中性粒细胞数目和体温较对照组绵羊偏高;绵羊肺脏表现不同程度的出血和肝变,脾脏和脑有出血现象。病理学观察到试验组绵羊心肌纤维断裂,肺脏支气管管腔上皮细胞脱落,炎性细胞浸润,从剖检羊肝脏、肺脏、脾脏、脑和心脏都分离到和感染时一致的细菌。采用消化道和肌肉注射方式人工感染绵羊成功复制了ExPEC在羔羊上的发病。3.绵羊肺源致病性大肠杆菌生物被膜形成能力研究:采用96孔微量板法和试管法定性和定量分析24 h时10株ExPEC BF形成能力,同时将BF形成阳性菌株于96孔板37℃培养6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h时测定OD570并观察BF形态特点;用PI和刀豆蛋白A染色观察在12h和24h时细菌核酸和多糖产生量。结果显示有4株细菌BF生成表现阳性,其中XJ-01株为中等阳性,XJ-03、XJ-05和XJ-07为弱阳性株;阳性株约60 h左右时BF的形成量最大;激光共聚焦显微镜观察到12 h和24 h时XJ-01BF形成能力强于XJ-07。上述结果说明来源于绵羊肺源的肠外致病性大肠杆菌能不同程度产生BF,但产生BF的能力较弱。4.绵羊肺源致病性大肠杆菌XJ-10对小鼠肺泡上皮的作用:为探究绵羊肺源ExPEC XJ-10对小鼠肺泡上皮细胞TC-1的作用,以肺炎克雷伯氏菌ATCC13883为阳性对照,大肠杆菌ATCC25922为阴性对照测定三株细菌在30 min、60 min、90 min和120min时黏附细胞菌量和2 h、6 h、12 h后侵袭细胞菌量,并用姬姆萨染色观察三株细菌在TC-1细胞表面黏附情况。结果表明,在四个时间点ExPEC XJ-10黏附细胞菌量与ATCC13883和ATCCA25922相比,均高于二者,差异显著（P<0.05）;侵袭试验结果发现在2 h、6 h和12h时,XJ-10侵袭细胞的菌量与ATCC13883相比差异极显著（P<0.01）;发现大肠杆菌ATCC25922对细胞没有侵袭能力。姬姆萨染色观察到XJ-10在细胞表面和间隙存在大量细菌,对TC-1细胞的黏附能力强于ATCC13883和ATCCA25922。