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雌激素是脊椎动物体内最重要的类固醇激素之一,与性别分化和性腺发育过程密切相关,雌激素受体（Estrogen receptor,ER）对雌激素发挥生物学功能的过程至关重要。目前发现了两类雌激素受体,分别是经典雌激素受体（Nuclear estrogen receptor,n ER）和新型膜雌激素受体:G蛋白偶联雌激素受体（G protein coupled estrogen receptor,GPER）。n ER又分为雌激素受体α（Estrogen receptor 1,ESR1）和雌激素受体β（Estrogen receptor2,ESR2）。n ER是最先发现的雌激素受体,参与动物体内多种生理活动。敲除实验表明缺失ER会影响动物性腺发育,甚至不育。中华鳖（Pelodiscus sinensis）是我国重要经济水产养殖物种,养殖历史悠久,鳖肉、血、背甲等具有一定的药用价值,全身是宝,深受消费者喜爱。中华鳖作为爬行动物也是研究脊椎动物性别分化和繁殖分子机制的理想材料。本研究以中华鳖为研究对象,克隆ESR1和ESR2基因cDNA全长序列,通过q-RT PCR分析二者在不同组织和胚胎发育时期的表达模式,通过腹腔注射激动剂和拮抗剂的方式研究n ER对中华鳖性腺的影响,为中华鳖的性别分化和性腺发育提供基础数据以供参考。实验结果如下:以中华鳖性腺总RNA为反转录模板,通过RACE实验方法获得ESR1/ESR2基因cDNA全长序列,经测序拼接得到ESR1 cDNA全长为6061 bp,共编码588个氨基酸;ESR2 cDNA总长6396 bp,编码556个氨基酸。二者都包含核受体超家族典型的DBD和LBD结构域。系统进化树结果显示RACE实验方法克隆得到的ESR1/ESR2 cDNA序列与龟鳖类亲缘关系最近,其次是爬行类,与中华鳖进化地位一致,说明克隆得到的序列就是中华鳖ESR1/ESR2序列。q-RT PCR分析ESR1/ESR2在组织和胚胎发育时期的m RNA表达。结果表明ESR1在中华鳖各个组织广泛表达,其中精巢表达量最高,随后是卵巢;ESR2仅在性腺、脑中表达。在雄性胚胎性腺发育关键时期,ESR1基因表达量随着时间逐渐增长,18期达到最高值,随后表达量降低;雌性胚胎中ESR1表达量随着发育时间逐渐降低,20期表达量上升后显著下降（P＜0.05）。相同发育时期中未检测到ESR2在m RNA水平中的表达。为探究ESR1/ESR2在中华鳖性腺中的定位,以p ET-32a为表达载体,构建重组质粒p ET32a-ESR1和p ET32a-ESR2,原核表达获得目的蛋白多肽。ESR1蛋白多肽为34.6k D,ESR2蛋白多肽为33.4 k D。将目的蛋白免疫小鼠,获得ESR1和ESR2多克隆抗体。ELISA法测定抗体效价分别为2.7×10~5和2.43×10~6。用制备的多克隆抗体进行免疫组化实验,结果显示ESR1/ESR2在精巢的间质细胞、生精细胞中表达;卵巢中定位于膜细胞中。为了深入研究ESR1和ESR2在性腺中的作用,使用特异性激动剂PPT和DPN分别对稚鳖进行腹腔注射,n ER拮抗剂ICI 182,780处理成年雄鳖。结果显示:PPT和DPN都使稚鳖的卵巢增大,卵母细胞数量增加,稚鳖的精巢中未发现形态学变化。激动剂处理雌鳖后使与卵巢发育有关的基因如:tsc2、Gn RH、eif4b、fshb表达量显著上升,rps6、mtor表达量降低。DPN处理的雄鳖精巢中,sycp3、spata6、picalm、evl表达量与对照组相比显著上升,stra8、cyclin D表达量显著下降。PPT处理雄性实验组中stra8、picalm表达量上升,sycp3、dmc1、spata6表达量下降。对成年雄鳖注射ICI 182,780后,血清中E2含量显著升高,并且观察到精巢中精母细胞增多,精子数量减少。q-RT PCR结果显示精巢中与精子发生相关的基因stra8、scyp3、dmc1、picalm、evl、boule、cdk1相对表达量显著上升。综上所述,ESR1/ESR2在m RNA水平和蛋白水平,都在性腺中表达;在性腺分化关键期,ESR1在雌雄胚胎呈差异性表达模式,而ESR2在性腺分化期不表达,结合n ER拮抗剂和特异性激动剂的研究结果,表明n ER对中华鳖性别分化和发育中发挥了一定的作用。