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禾谷镰孢菌是我国引起小麦赤霉病的主要病原菌。氰烯菌酯是一种新型的杀菌剂,化学结构新颖,作用机制独特,与现有的杀菌剂无交互抗性。该药剂在离体条件下,对小麦赤霉病菌的抑菌活性是苯并咪唑类杀菌剂多菌灵的4倍。目前,已经完成农业部的相关登记,并获得了全国农技推广中心的“防治小麦赤霉病2011-2013年重点推广杀菌剂品种”,已经成为防治小麦赤霉病主要药剂之一,并能够有效治理小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性。但是,本实验室的前期研究表明：该药剂在离体条件下容易获得小麦赤霉病菌对氰烯菌酯的抗药性,因此认为其具有中等—高等的潜在抗药性风险。为此,进行小麦赤霉病菌对氰烯菌酯的抗药性机制的研究迫在眉睫,为科学制定该杀菌剂的应用策略,延缓抗药性的产生和建立抗药性群体检测技术具有重要意义。本文研究了抗氰烯菌酯禾谷镰孢菌菌株和敏感菌株对5种外界胁迫因子、不同氮源、碳源的应答能力、胞内甘油和胞外多糖变化等的理化特征。实验结果表明：高抗菌株对N素的利用率高于敏感菌株以及低抗、中抗菌株；与亲本菌株2021相比,在1.4M山梨醇、5mM H2O2、Congred、高温、碱性胁迫压力下的菌丝生长显著下降；抗性菌株在0.4M LiCl的PDA上的生长速率比敏感菌株2021显著增加；除Y2021A、Y2021C以外,其他的抗性菌株对SDS的耐受性低于敏感菌株；低抗和高抗菌株对酸性环境的适应能力高于敏感菌株；在无药处理下,抗药性菌株的胞内甘油显著高于敏感菌株,且抗性菌株的抗药性水平等级无关；对LiCl的耐受力也显著高于敏感菌株；但在药剂处理下,抗／感菌株间胞内甘油含量和胞外多糖含量差异显著,呈无规律性变化。为探索禾谷镰孢菌对氰烯菌酯抗性的机制,本文以禾谷镰孢菌对氰烯菌酯不同抗性水平菌株为实验材料,进行RAPD分析寻找差异表达基因及其抗感菌株间的差异性RAPD位点。用从200个RAPD引物中筛选到的9条随机引物对供试的禾谷镰孢菌进行RAPD分析,共扩增65条带,集中在300～2000bp之间,多态性位点频率占69.23%,表明供试禾谷镰孢菌菌株具有丰富的遗传多样性,遗传距离在0.5384～0.8462之间。经过聚类分析,所有菌株共分为2组,第Ⅰ组是敏感菌株,第Ⅱ组是氰烯菌酯抗性菌株,后者的划分与菌株抗性水平高低没有相关性。利用cDNA-RAPD技术获得了敏感菌株和氰烯菌酯的抗性菌株之间差异表达的9个基因,涉及代谢、运动、调控、细胞信号传导以及其他生理生化途径。并利用实时荧光定量PCR对RAPD分析的差异表达基因进一步核实,发现不同差异基因表达模式不同；采用相同的技术,还获得了禾谷镰孢菌野生敏感菌株在EC90氰烯菌酯(0.5μg/mL)处理(0～36h)和无药处理间4个差异表达基因。FGSG-06149/FGSG-03716是野生型禾谷镰孢菌2021经氰烯菌酯处理一定时间后表达量发生上调／下调的两个基因。为了揭示这2个基因在禾谷镰孢菌对氰烯菌酯抗药性中的作用,以氰烯菌酯表现高抗的菌株(JS399-19HR) Y2021A为出发菌株,采用Double-joint PCR方法,构建含hph-hsv基因的载体,通过PEG介导的原生质体转化法分别同源置换禾谷镰孢菌FGSG-06149或者FGSG-03716基因,获得敲除FGSG-06149和FGSG-03716的单基因敲除突变体及其无遗传标记的原位回复突变体。经过Southern Blotting杂交和PCR验证,分别研究各敲除突变体及其回复突变体包括对氰烯菌酯的敏感性在内的生物学功能。敏感性测定结果表明：FGSG-06149或者FGSG-03716中的任何一个基因的敲除突变体对氰烯菌酯的敏感性显著下降；FGSG03716的敲除突变体产子囊壳能力、对NaCl、LiCl、耐酸性(pH=4)和30℃的耐受性显著下降,但产分生孢子能力和对KCl、SDS和强碱性的耐受力显著提高。FGSG06149的敲除突变体不能产子囊壳,对NaCl、LiCl、20℃和30℃的耐受性显著下降,但对KCl、SDS和强碱性(pH=11)、耐酸性(pH=4)的耐受力显著提高。因此认为：禾谷镰孢菌FGSG-06149和FGSG-03716与菌体对氰烯菌酯抗药性的相关基因。