研究背景肺动脉高压是指在静息状态下平均肺动脉高压高于或等于25mmHg的心血管疾病,该疾病以肺动脉压力升高为特点,是一种病例进行性发展的重症临床疾病。肺动脉高压病人一般会伴呼吸困难,头晕,运动不耐受等症状。据最新流行病学资料显示,在全球每100万人就有20人-50人患有肺动脉高压疾病。因此肺动脉高压已成为影响人类健康的重大疾病之一。PAH的发病机制通常认为肺循环过度充血、肺血管收缩和肺血管重塑是造成左向右分流肺动脉高压的三大原因。PAH的的发病机制通常认为是肺血管持续暴露于增加的肺血流将导致肺血管结构重塑和肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖和肺动脉内皮细胞(PAEC)功能障碍,进而引起肺血管阻力增加。形态学改变包括中膜肥厚、多细胞血管损伤,导致肺动脉血管梗阻、闭塞,内膜增厚。闭塞的血管限制了通过肺动脉的血流,增加了右心室后负荷,导致右心室肥大及右心室功能失调。高肺血流形成机械剪切力可使肺动脉内皮细胞(PAECs)结构功能和代谢发生变化,成为PAH发生的始动因素。肺动脉高压(PAH)是左向右分流型先天性心脏病(CHD)常见的合并症,相对于无PAH的先天性心脏病患者,合并PAH的CHD患者在手术后并发症较多,极易引发死亡,医护人员对患者的监护难度加大,但不能有效降低死亡率。严重的PAH在完全性肺静脉异位引流、动脉导管未闭、大型室间隔缺损、完全性房室隔缺损和的患者的婴幼儿期就有可能形成。如果PAH未及时得到及时的治疗,最终导致分流不可逆并产生艾森曼格综合征,严重影响预后。最终的结果就是导致右心衰竭,甚至肺血管阻力在CHD术后也会急剧升高。,因此,合并PAH是否能够得到有效控制对CHD患儿根治术后预后有非常重要的影响。换句话说,肺动脉高压在很大程度上决定了 CHD患儿的预后效果。继发性肺动脉高压是先天性心脏病常见并发症,目前,对此缺乏特异性无创诊断手段及药物治疗,严重影响了介入治疗或外科手术的预后效果,也成为是患者手术后仍有很高死亡率的重要原因。对先天性体-肺循环分流性心脏病相关肺动脉高压患者在出现临床表现前,采取早期诊断和积极干预是改善预后的关键。右心导管检查是一项有创诊断PAH金标准的检查方法,不易在基层医院普及。临床上缺乏PAH早期诊断的特异性标志物、无创的诊断PAH金标准和特异性药物治疗方法。目前PAH的治疗主要包括两个方面:一是使用特异性的PAH介质丝裂原(包括钙)阻断剂,另一个是增加内皮衍生血管舒张因子——NO、前列环素的浓度和持续时间。PAH的发病机制虽尚未完全阐明,PAH因其发病机制和病理过程相对复杂,因此在临床上还未能得到有效根治,对该疾病的研究刻不容缓、尽管在研究领域近年来对该疾病的治病机理的研究取得了很大的进展,也同时深入了研究了该疾病临床的治疗策略,但是进来来对临床治疗的研究还为能从根本上有效的解决所有存在的问题,于是,进一步扩展研究肺动脉高压发病的细胞及分子机制,有望为提出该疾病新的治疗方式提供可靠的坚实的证据及信息。小RNA分子(miRNA)是一组约有21-23个核苷酸的高度保守的非编码RNA,广泛存在于植物、微生物和哺乳动物中,在心血管疾病和肿瘤等多种疾病的发生发展中,miRNA通过与靶基因的3’UTR区域部分序列相结合,互补后降解已转录的靶基因的mRNA,或者抑制靶基因编码蛋白进而对各种疾病起到调节作用。研究表明,miRNA在PAH肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)和肺动脉内皮细胞PAECs的分化、增殖、凋亡等方面发挥重要调节作用。研究发现miR-21和microRNA17/92基因簇参与肺动脉内皮细胞内分泌功能的调控;miR-143、miR-145参与PASMCs增殖和分化的调控。但对在先天性心脏病继发性肺动脉高压血浆中miRNA的变化及对肺动脉高压发生、发展的调节作用却尚未见报道。血浆miRNA作为潜在的生物方法能检测miRNA具有简单、便宜等优点,能广泛运用于临床,循环miRNA在标志物用于诊断疾病和治疗疾病被越来越多的人研究。而且在血标本中,RT-PCR疾病早期诊断和特异性药物开发等临床基础方面的研究成为热点。随着大量的miRNA的发现,最初传统分子生物学方法可以研究单个或少数miRNA在疾病发生发展中的作用,而对于疾病的发生发展往往是不止一个甚至是多个功能相关的miRNA在起作用,人类miRNA分子有数百个,miRNA对某一疾病的调节不可能是只有一种或一类miRNA在起作用,因此往往选择其中一个的在疾病中异常表达的miRNA分子作为生物标记物可能对疾病的诊断意义不是不大,而想得到可靠有效的用于疾病临床诊断指标,由一组miRNA分子组成的特异差异表达谱会更加可靠。因此传统实验方法已经无法满足研究者对疾病整体全局的发展规律的研究,而随着高通量筛选技术、miRNA微阵列基因芯片杂交技术、第二代高通量测序技术的开展,以及生物信息学的预测工具及软件的开发,高通量的筛选参与某一疾病发生发展过程中的miRNA显得尤为重要。miRNA的表达具有高度特异性,使得在疾病中可能会有相同的一种或多种miRNA表达改变。因此,在研究某一疾病的表达谱时,需要纳入大量患者样本进行研究,进而发现共同的血浆miRNA表达谱,同时需要经过大规模的临床试验验证,才能最终应用于临床实践。同时,对于循环miRNA与PAH的发病机制及其作用靶点尚未清楚,因此,本课题以研究CHD继发PAH的血浆miRNA的差异表达为切入点,通过基因芯片测序和茎环的RT-PCR方法检测和验证VSD继发PAH的血浆microRNA,寻找循环中与PAH的差异表达miRNA,分析其功能,研究其发病机制和发现新的生物标志物是早期预防、早期诊断、治疗的重要课题,为成功救治CHD合并PAH的患者早期诊断和基因靶向治疗并改善预后提供理论依据。目的1.左向右分流先天性心脏病单纯性室间隔缺损不继发重度肺动脉高压患者和继发重度肺动脉高压患者血浆中的miRNA差异表达谱的建立与验证。2.关键差异miRNA与合并肺动脉高压患者临床资料相关性分析。3.关键miRNA在合并肺动脉高压的发生发展中的作用与机制研究。方法1差异表达谱构建:随机自2010年12月至2014年8月入住广东省心血管病研究所心儿科的患者中抽选6例诊断为室间隔缺损合并重度肺动脉高压(VSD/PAH重度)的患者和6例不合并肺动脉高压的患者。其中心脏手术中麻醉状态下测压导管直接测量肺动脉收缩压、体循环收缩压,选择肺动脉收缩压/体循环收缩压Pp/Ps≥0.75的患者为VSD-PAH组;选择肺动脉收缩压/体循环收缩压Pp/Ps<0.30的患者为对照组VSD-NPAH组。收集入选病人的血样标本6mL于EDTA抗凝管中,离心去杂质后使用mRNA抽提试剂盒提取血浆样本的总mRNA,经质检后采用丹麦Exiqon公司的miRNA微阵列芯片miRCURYTMArray进行杂交,用Axon GenePix4000B芯片扫描仪对图像信号进行扫描,使用GenePix pro V6.0数据分析软件进行数据处理。2荧光定量PCR验证:根据miRNA芯片检测的结果结合文献资料和生物信息学分析,从差异表达的miRNA分子中选取15个差异较为明显的miRNA分子,扩大样本到每组100例,采用茎-环的RT-PCR方法(stem-loopRT-PCR)研究方法进行检测,并且cel-mir-39作为实验中的内参对PCR数据进行标准化处理,对差异表达谱进行初步验证。各RNA数据均不符合正态分布,故使用非参数检验方法(Mann-Whitney U test进行差异统计,以中位数±四分位数间距表达各组数据分布情况。3临床资料相关性分析:巢式病例对照研究设计,入选单纯先天性体-肺循环分流性心脏病患者及相关肺动脉高压患者扩大样本至每组100例,并详细记录病人的年龄、体重、心脏各指标、血压等各临床指标等信息,采用Pearson相关分析经验证的差异miRNAs与各临床检测指标的相关性。4 miRNA-16作用研究:转染miR-16 mimics或inhibitor,细胞生长曲线实验和细胞迁移实验研究miR-16对细胞增殖和侵袭转移的影响。5.miRNA-16的靶基因预测和验证:运用miRNA靶基因预测数据库miRBase、Pictar、Targetscan 检索 miRNA-16 的靶基因;使用荧光定量-PCR 和western Blot方法检测miR-16对关键靶基因的调控作用;使用荧光素酶报告载体验证miR-16对关键靶基因的直接调控作用。6.miRNA-16作用机制研究:共同转染miR-16 mimics或inhibitor以及关键靶基因过表达载体和关键靶基因siRNA,细胞生长曲线实验和细胞迁移实验研究miR-16发挥生物学功能的分子机制。结果1.miRNA芯片结果显示与左向右分流先心病不合并肺动脉高压者血浆相比,重度肺动脉高压者血浆中101个miRNA表达上调超过3倍,54个miRNA表达下调超过3倍。2统计结果显示,在所验证的差异miRNA分子中,mirK12-8、mirK12-10a、mirK12-12、mirUS25-2、mir16、mir17a、mir19a、mir20a、mir21、mir22、mir92、mir98、mir143、mir204在合并肺动脉高压中均表达上调,具有统计学差异(p<0.05),与芯片结果变化趋势一致。3.Stepwise法相关性分析显示,目标miRNA在两组患者中与其临床指标具有明显相关性,其中 miR-16(R=-0.538)、Mir-17(R=-0.538)、Mir-21(R=-0.682)的表达与心脏彩超LVEDd呈显著负相关;miR-16(R=0.837)、Mir-22(R=0.659)、miR-92(R=0.785)、miR-US25-2(R=0.581)的表达与平均肺动脉压(MPAP)呈显著正相关:miR-16(R=0.752)、Mir-22(R=0.608)、miR-92(R=0.701)的表达与吸药前矫正的肺循环阻力呈显著正相关;Mir-17(R=0.315)、的表达与心脏彩超LA呈显著正相关;miR-16(R= 0.836)、Mir-22(R=0.713)、Mir-92(R=0.817)、Mir-us-25-2(R=0.603)的表达与导管指标 PAP 呈显著正相关;miR-16(R= 0.649)、Mir-22(R=0.550)、Mir-92(R=0.623)、Mir-us-25-2(R=0.445)的表达与导管指标 PVP 呈显著正相关;Mir-us-25-2(R=0.670)的表达与心脏彩超RA呈显著正相关;Mir-20a(R=0.823)、Mir-143(R=0.754)、Mir-204(R=0.808)的表达与红细胞分布宽度(BCV)呈显著正相关。4.miR-16的生物学功能:我们首先研究了 miR-16对HPASMC细胞增殖的影响。使用Invitrogen公司的siRNA转染试剂在PAH细胞和细胞中分别转染由吉玛公司合成的miR-16 mimics和inhibitor,细胞增殖实验显示,在HPASMC细胞中过表达miR-16可以促进HPASMC细胞的增殖;我们采用划痕实验检测HPASMC细胞转染miR-16之后的迁移能力。实验结果表明,与miR-16 mimics NC转染对照组相比,miR-16 mimics能使HPASMC细胞的迁移能力明显增强。与之相反的,同 miR-16 inhibitor NC 转染组相比,miR-16 inhibitor 能使 HPASMC细胞的迁移能力减弱。以上实验结果表明,miR-16能够显著促进HPASMC细胞的增殖和侵袭转移能力。5.miR-16的靶基因预测及验证:使用三个较为权威的数据库Target Scan在线软件、Pic Tar在线软件和MiRanda在线软件对的miRNA-16的靶基因进行预测,其中有33个靶基因在三个数据库共同被预测到。RT-qPCR的实验结果显示,在HPASMC中过表达miR-16后,RBM6的mRNA水平下降明显,而转染inhibitor组结合刚好相反。WesternBlot的实验结果显示,miR-16能够下调细胞中RBM6的蛋白水平,抑制miR-16的表达可以上调RBM6的蛋白水平。荧光素酶报告系统实验显示,转染miR-16 mimics有效抑制了连有RBM6 3’UTR区PGL4载体上的荧光素酶活性,RBM6 3’UTR突变区则无效果;相反的,而共同转染miR-16 inhibitor的239T细胞中荧光素酶活性明显增强,而RBM6 3’UTR突变区则无效果。6.miR-16通过靶向在HPASMC中的作用:本课题利用细胞迁移实验明确RBM6在miR-16促进细胞转移中的作用。在HPASMC细胞中加入miR-16的mimics后,过表达RBM6,然后检测细胞迁移和侵袭能力的变化。实验结果显示,加入miR-16的mimics后,细胞划痕间距明显缩短,增强了HPASMC细胞的迁移能力。在细胞中回补RBM6后,可以将miR-16促进的细胞迁移能力抑制回原来的75%作用。以上结果显示,下调内源性RBM6蛋白表达可以抑制细胞迁移和侵袭能力。同时,可以部分恢复miR-16对细胞迁移和侵袭的促进作用。综上所述,miR-16可能通过下调细胞RBM6的表达而促进细胞增殖和转移的发生。结论:1.芯片结果证实先天性心脏病合并重度肺动脉高压和为合并患者血浆中存在差异表达的miRNAs,提示血浆miRNAs在继发性重度肺动脉高压中起一定的调控作用。2.利用茎环荧光定量PCR对芯片中部分差异表达的miRNAs的表达进行大样本验证,证实芯片结果可靠。3.经生物信息学分析,得到差异表达的miRNAs与临床资料显著性相关,miRNAs越高,PAH病越差。提示这3个miRNA可以作为潜在的重度肺动脉高压的诊断因子。4.MiR-16在PAH表达明显上调,并能通过直接调控其靶基因RBM6促进细胞增殖和转移,提示miR-16可能与继发性肺动脉高压的发生、发展过程有关,可能成为继发性肺动脉高压潜在的早期诊断和治疗新靶点。