论文部分内容阅读
肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis,SE)是一种泛嗜性病原菌,寄生于人和动物肠道内,革兰氏阴性无芽孢直杆菌,大多数有鞭毛能运动。肠炎沙门氏菌不仅能引起畜禽疾病,还是重要的人类食源性致病菌。近年来,随养禽业的发展,肠炎沙门氏菌感染也越来越严重,其能够引起肉鸡生长迟缓,蛋鸡产蛋量下降、死亡,造成了严重的经济损失,且具有重要的公共卫生学意义。菌毛是肠炎沙门氏菌致病过程中重要的毒力因子之一,其在体内体外均可表达多种菌毛结构。I型菌毛(SEF21菌毛)广泛分布于沙门氏菌中,而SEF14菌毛特异性表达于肠炎沙门氏菌及相近的D-群沙门氏菌中,为探讨上述两种不同菌毛在肠炎沙门氏菌致病过程中的作用,本文以SEF14、SEF21菌毛为研究对象,利用肠炎沙门氏菌野生株50336和其SEF14、SEF21菌毛亚单位编码基因缺失株及相应回补株,通过体外菌毛表达、上皮细胞系黏附性能、易感动物感染实验综合分析SEF14、SEF21菌毛功能,为肠炎沙门氏菌和宿主互作研究及防控提供理论依据。1不同培养条件下肠炎沙门氏菌菌毛表达情况为进一步研究肠炎沙门氏菌SEF14菌毛的表达条件及SEF14、SEF21菌毛亚单位编码基因对肠炎沙门氏菌中其他菌毛及鞭毛表达的影响,本试验利用荧光定量RT-PCR方法检测了37℃静置、42℃静置、菌毛诱导(37℃CFA中静置60h)3种培养条件下肠炎沙门氏菌野生株50336中SEF14及SEF21菌毛表达情况,并检测了SEF14及SEF21菌毛亚单位编码基因单缺失株50336ΔsefA、50336ΔfimA及双基因缺失株50336ΔsefAΔfimA中其他菌毛及鞭毛主要亚单位编码基因的表达影响。试验结果显示：野生株50336在37℃CFA培养基静置60h的菌毛诱导条件下SEF14菌毛主要亚单位编码基因sefA表达量是对照条件(37℃静置)的13.8倍,SEF21菌毛主要亚单位编码基因fimA表达量和对照条件相当,42℃静置条件下sefA、fimΔ表达量分别是对照组的5.8、6.1倍；单、双缺失株对其他菌毛及鞭毛的主要亚单位基因的表达影响结果显示：诱导条件下,缺失株50336△sefA中fimA、 afgA、fliC基因的表达量分别是野生株的2.7、1.5、9.5倍,缺失株50336△fimA中sefA、 afgA、fliC基因的表达量分别是野生株的4.7、0.6、1.6倍,双缺失株50336ΔsefAΔfimA中sfgA、fliC基因的表达量分别是野生株的1.04、6.2倍；42℃静置条件下缺失株50336AsefA中fimA、afgA、fliC基因的表达量分别是野生株的0.5、2.2、1.3倍,缺失株50336△fimA中sefA、afgA、fliC基因的表达量分别是野生株的1.7、1.9、1.4倍,双缺失株50336ΔsefAΔfimA中afgA、fliC基因的表达量分别是野生株的3.6、2.2倍。上述结果表明在本研究中3种培养条件下SEF14、SEF21菌毛亚单位编码基因单缺失株及双基因缺失株对其他菌毛及鞭毛亚单位编码基因均呈上调表达影响,这一结果意味着不同的黏附因子(包括鞭毛)之间在不同培养体系中均呈现表达代偿,某一黏附因子的缺失,其他黏附因子代偿性表达提升,这一现象的具体机制有待于进一步研究。2肠炎沙门氏菌SEF14、SEF21菌毛与肠上皮细胞IPEC-J2和Caco-2的体外黏附作用为研究SEF14、SEF21菌毛对肠炎沙门氏菌致病过程中的影响,本实验利用肠炎沙门氏菌野生株50336、单缺失株50336ΔsefA、0336ΔfimA、双缺失株50336ΔsefAΔfimA、相应回补株50336ΔsefA (pBRA)、50336ΔfimA (pACYCF)和50336ΔsefAΔfimA(pBRA+pACYCF)与不同的上皮细胞系(猪肠上皮细胞IPEC-J2及人结肠癌细胞Caco-2)进行其黏附性能的研究。试验结果显示：上述菌株均能与IPEC-J2及Caco-2细胞有效黏附,且细菌与细胞作用随时间延长细菌黏附数量呈增多趋势；在细菌和这两种细胞系共同孵育1h和4h时,各菌株与IPEC-J2细胞黏附数量是Caco-2细胞的2-4倍；在两种细胞模型的黏附试验中双缺失株50336ΔsefAΔfimA的黏附数量都明显少于野生株,且在IPEC-J2试验中1h、Caco-2试验中4h时双缺失株的黏附数量与野生株相比达到显著水平,但是单缺失株50336ΔsefA、50336ΔfimA与细胞系的黏附数量随较野生株有下降趋势,均未达到显著水平。本实验结果表明肠炎沙门氏菌与肠上皮细胞的黏附作用尽管受某一特定因子如SEF14菌毛或者SEF21菌毛的单一作用影响,双缺失株对黏附性能的影响较大,说明多种菌毛结构或黏附因子之间可能存在协同作用；Caco-2细胞系和IPEC-J2细胞系作为研究沙门氏菌致病作用的主要细胞模型,但这两种细胞系来源不同,且都是在塑料表面生长成单层来进行进一步实验,肠道上皮的功能和特点不能完全模拟,可能展现与肠炎沙门氏菌的黏附作用的差异,肠炎沙门氏菌对IPEC-J2细胞系的黏附性比Caco-2细胞系强,且肠炎沙门氏菌与肠上皮细胞之间的作用是复杂的、多面的,有待于更深入的研究。3荧光定量RT-PCR检测雏鸡感染肠炎沙门氏菌后血液中TLR4、TLR15、 NRAMP mRNA的表达鸡Toll样受体4(TLR4)、oll样受体15(TLR15)、天然抗性相关巨噬细胞蛋白(natural resistance-associated macrophage protein, NRAMP)在识别和抵抗病原微生物初始过程中发挥重要作用。为探索肠炎沙门氏菌SEF14、SEF21菌毛是否参与肠炎沙门氏菌对易感宿主-雏鸡的初始致病过程,本研究建立雏鸡动物模型,检测不同肠炎沙门氏菌标准株及相关菌毛突变株感染雏鸡后血液中TLR4、TLR15、NRAMP mRNA的表达水平。结果显示：在肠炎沙门氏菌感染后的不同感染进程中感染组与对照组相比血液中TLR4、TLR15、NRAMP mRNA表达量呈先上升后趋于一致的波动变化,表明鸡TLR4、TLR15、NRAMP的基因表达与肠炎沙门氏菌感染密切相关；缺失株50336ΔfimA攻毒组攻毒后1d时雏鸡血液中TLR4及TLR15表达量上升,分别是野生株攻毒组的2.46和2.5倍,单缺失株50336ΔsefA及双缺失株50336ΔsefAΔfimA攻毒组与野生株组相比没有明显变化,表明SEF21菌毛影响肠炎沙门氏菌感染雏鸡后血液中TLR4及TLR15表达；缺失株50336ΔfimA攻毒组雏鸡血液中NRAMP基因表达量在攻毒后3d时达野生株组11.55倍,表明肠炎沙门氏菌SEF21菌毛的表达影响抗菌基因NRAMP的表达。其他相关缺失株攻毒组和野生株组相比差异不大可能是由其他黏附因子代偿性表达所致(参考研究一),或者SEF14菌毛不是TLR4或TLR15的相关配体,关于SEF21和SEF14菌毛在这一过程中的具体作用机制还有待于进一步深入研究。