lncRNA对从江香猪肌肉成纤维细胞增殖影响的研究

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生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)在动物生长发育过程中具有重要作用,长链非编码RNA(lncRNA)也在动物体胚胎发育、细胞增殖与细胞分化等过程中发挥重要的作用,本文旨在研究与GHR相关的lncRNAs对从江香猪肌肉成纤维细胞增殖的影响。本研究采用贵州从江香猪和大白猪为试验材料,利用SWChen2.3程序、组织表达谱、生物信息学分析、分子克隆、原代细胞培养、细胞转染、细胞增殖等技术,从miR-146b-3p入手,通过碱基互补配对筛选并鉴定出GHR相关的lncRNAs,检测从江香猪肌肉成纤维细胞增殖相关基因的表达水平,分析其对肌肉细胞增殖的影响。从lncRNA的角度解析GHR对从江香猪生长发育的调控作用。其主要研究结果如下:1.GHR基因相关miR-146b-3p的克隆及其表达规律的初步研究miR-146b-3p在从江香猪和大白猪各检测的组织中均有表达。其中,miR-146b-3p在从江香猪小肠和大肠组织中具有高表达量,在背最长肌中表达量最低(P<0.01);在大白猪中肺脏组织中表达量最高,心脏组织中最低(P<0.01)。miR-146b-3p在从江香猪各组织中的表达量均显著高于大白猪(P<0.05),在从江香猪肌细胞中超表达后GHR基因表达量极显著下调。同时将肌细胞共转染PM-U6-miR-146b-3p和EDP-C-UTR载体,转染48 h后检测双荧光蛋白强度,通过计算相对荧光强度发现miR-146b-3p能显著抑制双荧光蛋白的相对荧光强度(P<0.05),说明miR-146b-3p可通过作用GHR的3’UTR区调控GHR的表达。为下一步筛选出GHR相关的lncRNA奠定基础。2.GHR基因相关lncRNAs的筛选与鉴定、组织表达及载体构建为预测出GHR相关的lncRNAs,通过NCBI获取猪GHR的m RNA(Gen Bank No.XM_013990636.2)3’UTR序列,miRBase数据库获取miR-146b-3p序列,通过SWChen2.3(https//ylchen-swchen.lofter.com)程序及NONCODE数据库中(http://www.NONCODING.org/)猪lncRNAs数据库进行预测分析。成功筛选出6条lncRNAs,选取评分较高的一条序列NONSUST017828.1(命名为lncGHR1)作为进一步研究的候选lncRNA。利用生物信息学分析发现lncGHR1具有丰富的二级结构,3个开放阅读框,与miR-146b-3p、miR-3670、miR-1909-5p、miR-3191-5p、miR-6858-3p等存在相互竞争作用。lncGHR1在从江香猪与大白猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠和背最长肌组织中均有表达。lncGHR1在从江香猪脾脏和肺脏表达量较高,除肝脏外各组织中的表达量均极显著高于大白猪(P<0.01)。同时成功构建其T克隆载体与真核表达载体lncGHR1-CMV,为下一步研究lncGHR1在细胞水平上的功能奠定基础。3.从江香猪肌肉成纤维细胞原代培养及其增殖研究本试验成功分离、培养出从江香猪肌肉成纤维细胞,并通过细胞冻存、复苏及铺板培养后,超表达lncGHR1,用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,在转录分子水平上检测GHR、hippo信号通路中的增殖相关指标基因YAP和TAZ的表达情况。分析数据得出,超表达lncGHR1能使试验组细胞增殖率显著高于空白对照组(P<0.05),且q RT-PCR检测结果发现lncGHR1在从江香猪肌肉成纤维细胞中均极显著表达(P<0.01),在超表lncGHR1达后GHR与TAZ表达量显著上调(P<0.05),而YAP在前后表达差异不显著。
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