论文部分内容阅读
目的： 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是人类化脓性感染中最常见的致病菌。金黄色葡萄球菌主要通过产生多种毒力因子致病，常见的毒力因子包括肠毒素、溶血素、凝固酶、耐热核酸酶、溶纤维蛋白酶、透明质酸酶、杀白细胞素等。Es xA为金黄色葡萄球菌分泌的一个重要毒力因子，可以引起宿主脓肿的发生，另外 Es xA蛋白可通过易位子穿过宿主细胞膜，进入细胞内，逃避宿主机体免疫应答，同时分泌或协同多种毒力因子引起宿主细胞的溶解凋亡。本研究通过对金黄色葡萄球菌进行 PCR扩增目的 EsxA基因，构建重组质粒并进行基因序列分析、蛋白的原核表达、纯化；并检测患者血清 EsxA特异性 IgG， IgG1，IgG2；构建金黄色葡萄球菌感染小鼠模型，分离小鼠脾细胞，观察其与EsxA蛋白体外共培养时细胞因子IFN-γ、IL-4的水平变化，探讨金葡感染中EsxA相关免疫特性，为其疫苗研究奠定基础。 方法： 根据 GenBank中 EsxA的序列，设计特异性引物，以临床确诊为金葡菌的DNA为模板PCR扩增EsxA基因，PC R产物纯化后用EcoRI、XhoI酶切，连接到pET-28a(+)载体，转化到大肠杆菌感受态BL21（DE3），对质粒进行双酶切鉴定和基因测序鉴定。用IPTG诱导表达重组蛋白，His标签单克隆抗体进行免疫印迹证实重组蛋白的表达。用His柱纯化重组蛋白，Western blot分析其免疫原性。使用纯化蛋白包被ELISA反应板，检测金黄色葡萄球菌感染患者血清EsxA特异性IgG,IgG1及IgG2水平。构建金黄色葡萄球菌感染的小鼠模型，取其脾细胞进行体外培养，分别用EsxA蛋白及植物血凝素（PHA）刺激，检测细胞培养液上清的IFN-γ，IL-4水平。 结果： 用临床鉴定为MRSA的菌株基因组为模板，PCR扩增EsxA基因，基因大小为294bp；重组的pET-28a-EsxA基因经双酶切鉴定可见目的片段，基因测序结果显示EsxA在正确阅读框内，起始于ATG，终止于TAA，预测分子量为11036.2，等电点为4.61。基因同源性分析显示其与 GenBank报道的金黄色葡萄球菌2395 USA500株（菌株序列号为CP:007499.1）对比同源性达到99.6％。IPTG诱导后SDS-PAGE电泳，pET-28a(+)-EsxA/BL21在相应分子量14.5kDa可见融合蛋白，免疫印迹可见目的蛋白。ElISA结果显示金葡菌感染病人EsxA特异性IgG,IgG1， IgG2 OD值分别为（0.3286±0.293）,（0.187±0.216），（0.161±0.207）。感染金葡菌儿童和健康儿童在血清EsxA特异性IgG抗体水平存在显著差异(p<0.05)。IgG1、IgG2抗体水平也有差异，两者具有统计学意义(p<0.05)。小鼠感染后血清EsxA特异性IgG,IgG1，IgG2a OD值分别为（0.530±0.029），（0.1602±0.125），（0.314±0.117）。IgG，IgG2a水平存在显著差异。脾细胞培养上清细胞因子IFN-γ、IL-4显著升高，IFN-γ水平升高更明显。 结论： 成功构建了Es xA的原核表达系统，表达、纯化了重组Es xA蛋白，金葡菌感染病人血清EsxA特异性IgG，IgG1，IgG2水平显著升高，以IgG1占优势。Es xA刺激金葡感染小鼠脾细胞IFN-γ，IL-4显著升高，以IFN-γ为甚，表明EsxA可诱导感染小鼠Th1优势的细胞免疫。