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益生菌被定义为当以适当的量施用时,赋予宿主健康益处的活的微生物。通常指的益生菌为益生性细菌,由于细菌培养方式简单、增殖速度快、环境耐受性强等特点,被广泛开发和应用。但是益生性细菌也有其致命的弱点,例如基因转移,容易导致抗性基因的传播。真菌具有遗传隔离的特性,能够有效避免抗性基因的转移。真菌细胞壁中的β-葡聚糖已被证明是一种高效的益生物质,能够调节机体的免疫水平。另外,真菌作为载体表达的基因工程产物具有天然构象,可以作为良好的疫苗输送平台。这些都表明真菌具有作为优良益生菌被开发的潜力。益生菌的作用机制是复杂的,但主要包括以下几个方面。第一,增重和提高饲料利用率是开发畜禽肠道益生菌的首要目的,所以提高生长性能是权衡益生效果的重要指标。第二,消化系统的发育状况影响机体对营养物质的吸收和利用,促进消化系统的发育,也是评价益生菌的一个因素。第三,免疫状态直接决定机体的健康水平,益生菌株应该能够调节宿主的免疫水平。最后,肠道菌群影响机体代谢和对营养物质的吸收,益生菌株能够维持肠道菌群的平衡,并促进肠道菌群向有益的方向发展。现阶段,益生菌株主要从自然界分离获得,通过随机诱变或者基因定向改造获取益生菌株的方式比较少见。本实验室前期从雏鸡粪便中分离得到一株D.rugosa SD,预实验发现D.rugosa SD在雏鸡肠道不定植且不耐受肠道恶劣内环境。本课题基于此菌株,通过诱变筛选获得肠道定植能力强的变异株,旨在进一步研究其菌株特异性及其益生作用机制。1.肠道定植菌株筛选及菌株特异性分析本研究以存活率50%~70%为标准,确定了UV及NTG诱变剂的最佳诱变条件:15J,0.4min和50 mg/m L,40 min。进而以复合诱变的方式,以在雏鸡肠道内定植12 h为筛选条件,成功筛选到23株突变菌株。经过20次遗传稳定性检测,最终获得一株能够稳定遗传的变异菌株。通过物种进化分析发现,变异菌株与模式菌株D.rugosa ATCC10571的亲缘关系最近(自展值100%),最终命名为D.rugosa SD-17。D.rugosa SD-17生物学特性发生了显著变化,主要表现在:D.rugosa SD-17在41℃的增殖能力显著增强;D.rugosa SD-17在YTD固体培养基上的菌落中央出现明显的凹陷;经过透射电子显微镜发现D.rugosa SD-17的细胞壁显著增厚;D.rugosa SD-17的细胞壁及其β-葡聚糖含量显著提高。2.D.rugosa SD-17的益生潜力研究为了进一步探究D.rugosa SD-17的益生潜力,本研究通过模拟肠道内环境(胃酸、胆盐和温度)的方法来研究D.rugosa SD-17的耐受性。结果表明经过人工胃酸(p H=2)处理8 h,D.rugosa SD-17的存活率仍接近50%;0.3%的人工胆盐对D.rugosa SD-17的增殖没有显著影响;D.rugosa SD-17在畜禽肠道温度(37℃~41℃)下能够良好生长。通过细胞粘附试验发现,D.rugosa SD-17对Caco-2细胞的粘附率为61.5%,显著高于模式菌株。使用D.rugosa SD-17灌胃雏鸡,并在16 h后收集肠内容物涂板培养,结果从回肠内容物中分离出大量的D.rugosa SD-17,这说明D.rugosa SD-17在雏鸡肠道内的主要定植部位为回肠。以上结果表明D.rugosa SD-17对模拟的肠道内环境有良好的耐受力并能够在雏鸡肠道内短暂定植。3.D.rugosa SD-17对雏鸡的益生作用研究本研究通过急性毒性试验和慢性感染性试验来评价D.rugosa SD-17对雏鸡的安全性。结果均未引起雏鸡死亡,另外,雏鸡精神状态良好、采食量正常、表观和内脏无病理性变化、全血检测指标正常,这些结果说明D.rugosa SD-17对雏鸡没有致病性。动物益生性试验发现,饲料中添加D.rugosa SD-17会显著提高雏鸡增重和饲料利用率,并且促进回肠绒毛的发育,回肠恰巧也是D.rugosa SD-17最主要的定植部位,这表明该菌株对回肠上皮细胞可能有一定的刺激作用。在刀豆蛋白A(Con A)的刺激下,D.rugosa SD-17组的淋巴细胞增殖能力显著提高。通过流式细胞术检测淋巴细胞亚群,结果发现D.rugosa SD-17会显著提高CD3+CD4+细胞(T helper cells,Th)的比例。另外,通过荧光定量PCR检测Th细胞表面的标志性细胞因子,结果发现D.rugosa SD-17会促进Th1细胞标志性细胞因子的基因表达量,而对Th2细胞标志性细胞因子的基因表达量没有影响,这些结果表明D.rugosa SD-17对雏鸡有一定的免疫调节作用。4.D.rugosa SD-17对肠道菌群的影响本研究通过16S扩增子测序分析回肠菌群、盲肠菌群、结肠菌群和粪便菌群的变化来揭示D.rugosa SD-17对小鼠的肠道内环境的影响。首先,D.rugosa SD-17的刺激引起回肠菌群丰富度的显著提高。其次,D.rugosa SD-17的刺激会引起粪便菌群中厚壁菌门的比例升高,拟杆菌门的比例降低,这有利于提高机体对能量的吸收和利用。另外,D.rugosa SD-17的刺激会引起有益菌属(乳酸杆菌属)比例的显著升高。这些结果初步表明,D.rugosa SD-17能够调整小鼠肠道的菌群结构,并增加有益菌群的比例。5.D.rugosa SD-17对代谢通路的影响根据小鼠肠道菌群测序的结果,本研究通过KEEG数据库进行富集分析,旨在揭示D.rugosa SD-17对小鼠代谢水平的影响。从结肠菌群中富集到5个D.rugosa SD-17特异性代谢通路,分别涉及细胞粘附分子、细胞骨架的调节、病毒的感染及心肌病等代谢领域。本研究选取细胞粘附分子通路进行分析,发现E-cadherin是肠道粘附连接的核心蛋白。为了进一步研究D.rugosa SD-17对小鼠结肠粘附连接的影响,我们用D.rugosa SD-17分别刺激结肠组织和Caco-2细胞,结果都显示E-cadherin表达量显著提高。另外,粘附连接的其它相关蛋白(β-catenin、ZO-1等)的表达量都发生了不同程度的显著上调。这些结果表明D.rugosa SD-17显著提高结肠粘附连接的相关蛋白的基因表达量,对维持肠道结构有一定的促进作用。综上所述,本课题成功获取一株肠道定植能力强的益生性菌株D.rugosa SD-17,该菌株具有明显的菌株特异性,对雏鸡有良好的益生作用,并能够优化肠道菌群和维持肠道结构。本研究为深入研究畜禽肠道益生菌株的作用机制奠定基础,并为畜禽肠道益生菌的开发和应用提供指导意义。