论文部分内容阅读
目的:肿瘤坏死因子-α(TNF-α)主要是由巨噬细胞和单核细胞分泌的一种具有多种生物学功能的炎症因子。TNF-α能够诱导肿瘤细胞的凋亡,抵抗细菌和病毒的感染,促进组织损伤的修复等。但是体内TNF-α的过量表达可以导致很多自身免疫性疾病,例如:类风湿性关节炎、Crohn病、溃疡性结肠炎、强直性脊髓炎、牛皮癣、硬皮病等。所以TNF-α是这些疾病的有效治疗靶点。目前已经有5种TNF-α的拮抗剂进入临床应用。然而这些单克隆抗体在大规模的应用上存在很多技术限制和缺陷:昂贵的生产方式,低组织渗透力,潜在的免疫原性。因此,研究一种靶向TNF-α且生产成本较低的治疗方法,具有重要的意义。与传统抗体相比,纳米抗体具有很多单克隆抗体所不具备的优势:高表达、易纯化,高稳定性和可溶性,高亲和性。本课题目的是通过基因工程抗体技术,筛选获得能够高效中和TNF-α炎症因子的特异性纳米抗体。方法:(1)构建anti-TNF-α VHH T7噬菌体抗体库:1.合成人源的TNF-α基因并构建TNF-α-pet28a表达载体,然后将其转化到BL21(DE3)中进行原核表达,用镍柱亲和层析的方法纯化人源的TNF-α蛋白,在L929细胞中检测TNF-α的生物活性;2.通过Protein G和Protein A亲和层析,纯化骆驼血清,得到骆驼的重链抗体,并将其免疫注射小鼠,获得鼠抗骆驼重链抗体的多克隆抗体;3.用人源TNF-α蛋白免疫骆驼,免疫结束后,提取外周血淋巴细胞的mRNA,通过逆转录和巢式PCR获得VHI基因;将VHI基因插入到载体T7噬菌体的双臂,克隆位点为衣壳10B蛋白,再进行体外包装,成功构建anti-TNF-α VHH-T7噬菌体抗体库,然后分别用噬菌斑分析检测该抗体库的库容量,PCR鉴定抗体库的重组阳性率,随机挑选重组T7噬菌体阳性克隆,测序检测该抗体库的多样性。(2)anti-TNF-α VHH-T7抗体库的筛选:运用TNF-α的His-tag对Ni-IDA介质的亲和性,对anti-TNF-α VHH-T7抗体库进行亲和淘选,使高亲和性的anti-TNF-α VHH-T7噬菌体大量富集;然后测序获得其VHH序列;原核表达高亲和性的anti-TNF-α VHH抗体,镍柱亲和层析纯化anti-TNF-α VHH抗体。(3)分析anti-TNF-α VHH抗体的特性:分别检测anti-TNF-α VHH抗体的抗原结合活性,热稳定性,以及对TNF-α介导的细胞毒性的抑制作用。结果:(1)成功表达纯化了人源的TNF-α蛋白,对SDS-PAGE结果进行灰度分析,纯化所得的TNF-α蛋白纯度大于90%,对L929细胞的半数致死浓度为3 ng/ml。(2)成功纯化得到骆驼的重链抗体,制备了鼠抗骆驼重链抗体多克隆抗体。(3)构建了 anti-TNF-αVHH-T7噬菌体抗体库,其库容量为4×106pfu,重组阳性率高达98%,并且具有很好的多样性。(4)筛选得到了 3种特异的anti-TNF-α VHH抗体:TNF-αNB1,TNF-α NB7,TNF-α NB 9;检测这3种anti-TNF-α VHH抗体的抗原结合活性,其抗原结合活性由高到低的依次为:TNF-αNB9,TNF-αNB7,TNF-αNB 1;37℃环境下放置96小时后,这3种anti-TNF-α VHH抗体的抗原结合活性仍然在80%以上;3种anti-TNF-α VHH抗体均能有效抑制TNF-α的细胞毒性,抗体的半数抑制浓度分别为:TNF-α NB9的LD50为20 nM,TNF-α NB1 的 LD50 为 100 nM,TNF-α NB7 的 LD50 为 450 nM。结论:(1)3种anti-TNF-α VHH抗体中TNF-α NB 9的抗原结合活性最高。(2)TNF-α NB 1,TNF-α NB 7,TNF-α NB 9都具有很好的热稳定性。(3)3种anti-TNF-α VHH抗体在体外都能够有效中和TNF-α炎症因子,其中TNF-α NB 9的效果最好,LD50为20 nM。(4)TNF-α NB9具有高产量、高可溶性、高稳定性的优点,能够在体外有效的中和TNF-α,为TNF-α引起的疾病提供了一种高性价比的治疗新方法。