1.研究目的　　植物作为固着生长的生命体，无时无刻不受到外界环境的影响，当环境不适合植物生长和发育时就会对其产生胁迫。胁迫主要分为生物胁迫和非生物胁迫两种，其中非生物胁迫是导致粮食作物减产的重要原因。干旱是最重要的非生物胁迫之一，每年全世界主要粮食作物减产的50％都是由干旱胁迫造成的。随着干旱和半干旱地区面积的增加、全球气候的变暖及水资源的短缺等问题日益严重，干旱胁迫的危害越来越大。因此鉴定干旱胁迫相关的基因并研究其功能具有非常重要的理论意义和应用价值。　　植物在应对非生物胁迫过程中会启动或调节很多相关基因的表达。除了从转录水平调节胁迫相关基因的表达以外，蛋白翻译后的修饰在这一过程中也起了关键作用。泛素化作为一种重要的蛋白翻译后的修饰方式，在高等植物中参与了很多细胞学过程，包括细胞周期、光周期、激素、信号转导、新陈代谢和DNA修复及植物应对胁迫的反应。数量众多的泛素连接酶决定了底物特异性。U-box泛素连接酶是最近发现的一类具有泛素连接酶活性的E3，也是泛素/蛋白酶体系统（Ubiquitin/proteasomesystem）的重要组分。我们对现有的芯片数据库进行大规模的分析及筛选，试图寻找参与胁迫响应过程的RING或U-box类型的泛素连接酶。　　2.研究方法与结果　　通过筛选发现At1g60190的表达受到多种非生物胁迫和ABA诱导。在正常条件下，我们没有检测到AtPUB19的转录产物，但干旱、高盐、冷和ABA诱导后，表达量明显升高。通过Northernblot检测该基因在不同组织中表达情况，结果发现AtPUB19在幼苗中没有表达；在根、花和角果中有微弱的表达，在茎和叶片中表达都比较高。AtPUB19基因启动子驱动GUS基因表达结果再次验证了Northernblot的结果，更详细的组织表达模式分析发现该基因在花药及角果的顶端中有较高的表达。进一步对其编码的蛋白进行分析发现，AtPUB19编码一个U-box类型的泛素连接酶，即PlantU-boxProtein19（PUB19）。体外泛素连接酶活性检测实验证明AtPUB19具有泛素连接酶活性。为了研究AtPUB19的亚细胞定位，我们在AtPUB19的N端融合了绿色荧光蛋白（GFP）。利用烟草瞬时表达的方法表达GFP-AtPUB19融合蛋白，荧光共聚焦显微镜观察发现绿色荧光信号位于细胞周围，呈现不规则分布；在原生质体中表达GFP-AtPUB19也可以得到同样的结果。为了进一步研究该蛋白在细胞内的分布情况，我们进行了细胞组分分离和Westernblot实验，利用GFP的抗体检测蛋白信号。结果显示在总蛋白、膜组分及加入破膜剂后的可溶组分中检测到目的蛋白，在可溶组分及加入破膜剂后的沉淀中检测不到该蛋白信号，说明AtPUB19是一个膜相关的蛋白。为了进一步研究该基因的生物学功能，我们从ABRC订购了两条T-DNA插入突变体，分别命名为pub19-1和pub19-2。经基因组和转录水平分析发现其均为knock-out突变体。同时我们构建了过表达植物，并从转录水平和翻译水平对过表达植株进行了检测，选出两条表达量较高的株系进行后续研究，命名为OX-1和OX-2。通过对突变体和过表达植物的表型进行研究，我们发现T-DNA插入突变体表现为对ABA的敏感性增加，并加强了ABA诱导的气孔关闭进而提高植物的耐旱性。过量表达AtPUB19则使拟南芥表现出与此相反的表型。干旱处理后与野生型相比，很多ABA和胁迫相关基因如RAB18、ADH1、COR47、RD22和RD29A的表达量在突变体中上调，而在过表达植物中下调。　　３.研究结论　　AtPUB19的表达受干旱、高盐、低温和ABA的诱导。AtPUB19在很多组织器官中表达，包括根、茎、叶、花和角果，但在幼苗中不表达。AtPUB19是一个U-box类型的泛素连接酶，具有保守的U-box结构域和5个ARM结构域。AtPUB19是一个膜相关的蛋白,具有体外泛素化活性。降低AtPUB19的表达量可以加强植物对ABA的敏感性，增强ABA诱导的气孔关闭，提高一些ABA和胁迫相关基因的表达，最终导致拟南芥表现出抗旱的表型。AtPUB19过表达对植物有相反的作用。以上实验结果表明AtPUB19负调控拟南芥对ABA及干旱的响应。