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-3-肝癌是严重威胁人类健康和生命的常见的恶性肿瘤之一。尽管肝癌的危险因素已经得以很好的定义,但其发病原理仍不清楚。增强对癌细胞分化、进展的重要分子的认识有助于发展治疗肝癌的有效靶向治疗策略。HAb18G/CD147分子是由我室确定的新型肿瘤标志物,是CD147家族成员,属于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily,IgSF)类粘附分子。在多种癌中高表达,而在正常组织不表达或极低表达。其不仅可以诱导成纤维细胞合成MMPs,降解肿瘤细胞周围基质,使肿瘤细胞易于扩散和转移,也可]诱导内皮细胞中VEGF的表达,从而促进新生血管的生成。这些研究结果提示HAb18G/CD147分子在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用。然而,该分子的调控机制目前仍不十分清楚。microRNA(miRNA)是一类长度为20-25nt,从发夹结构前体加工而来的具有基因调控功能的小分子非编码RNA,能与受其调控的靶mRNA的3’非编码区(3’UTR)互补结合,通过降解靶基因mRNA或抑制mRNA的翻译在真核基因表达的转录后调控过程中发挥重要作用,并广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及细胞周期调控等过程。新的研究证明,miRNA与细胞的癌变及多种肿瘤的发生有着极为密切的关系,参与癌症的发生、发展、侵袭和转移。本研究旨在阐明miRNA是否参与HAb18G/CD147分子的转录后调控及其机制。全文分为三个部分。第一部分;参与HAb18G/CD147分子转录后调控的microRNA筛选与鉴定利用miRNA芯片技术筛选人正常肝细胞系QZG和人肝癌细胞系SMMC-7721中表达差异的miRNA。研究发现:与正常肝细胞相比, miR-338-3p、miR-193a-3p及miR-146a在SMMC-7721中显著低表达。生物信息学预测提示miR-146a在HAb18G/CD147的3’UTR区存在可能的结合位点,其结合位点位于HAb18G/CD147的3’UTR区的第80~第86个碱基。Stem-loopRT-PCR及real-timePCR结果均表明miR-146a在QZG细胞中表达水平较SMMC7721中高,而且与HAb18G/CD147在表达水平上呈负相关。提示miR-146a有可能为HAb18G/CD147在转录后水平上的负调控miRNA分子。第二部分:microRNA146a对HAb18G/CD147表达的影响Western blot结果表明,肝癌细胞(FHCC98、SMMC7721)中转染miR-146a可以显著抑制细胞内HAb18G/CD147的表达水平,而给正常肝细胞系QZG中转染AS-miR-146a以封闭内源性miR-146a的作用,可促进QZG细胞中HAb18G/CD147蛋白表达的相应上调,表明miR-146a与HAb18G/CD147存在负调控关系。利用半定量RT-PCR及RealtimePCR检测转染miR-146a/ AS-miR-146a后,对细胞内HAb18G/CD147 mRNA水平的影响,结果发现转染前后细胞内HAb18G/CD147 mRNA水平并未发生明显改变。结果表明细胞内miR-146a对HAb18G/CD147蛋白表达的负调控,并不涉及HAb18G/CD147 mRNA水平的改变,其机制为转录后调控。明胶酶谱法及人工重组基底膜侵袭小室实验显示,转染miR-146a下调两株HCC细胞(FHCC-98及SMMC7721细胞)中HAb18G/CD147分子的表达,可显著抑制HCC细胞与成纤维细胞的共培养体系中,MMPs的分泌及细胞的侵袭潜能(p < 0.05);而封闭人正常肝细胞系QZG中miR-146a,上调HAb18G/CD147蛋白分子的表达,进而可促进QZG细胞与成纤维细胞的共培养体系中,MMPs的分泌并显著提高细胞的侵袭能力(p < 0.05)。综上所述,miR-146a通过负调控HAb18G/CD147参与了MMPs的分泌和细胞的侵袭和转移的调控。第三部分:HAb18G/CD147分子3’UTR区中miR-146a作用靶点的鉴定为检测miR-146a对HAb18G/CD147蛋白表达的负调控作用是否由于其靶位点位于HAb18G/CD147 mRNA的3’UTR。我们构建了含野生型和突变型HAb18G/CD147 3’UTR区的萤火虫荧光素酶报告基因载体,分别命名为pGL3-18G wt和pGL3-18G mut,分别与海肾素荧光酶素报告基因载体和miR-146a共转染到HEK-293细胞中。海肾素荧光酶素报告基因载体作为内对照。转染24小时后,分别检测各组细胞中萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。双荧光素酶报告基因实验结果显示,与转染空载体对照组相比,共转染pGL3-18G wt和miR-146a组中萤火虫荧光素酶的活性显著下降(P = 0.000),而共转染pGL3-18G mut和miR-146a组中萤火虫荧光素酶的活性则无明显变化。以上结果为miR-146a直接作用于HAb18G/CD147的3′UTR区提供了强有力的支持。综上所述,本研究阐明了HAb18G/CD147的表达受miR-146a的转录后调控;miR-146a对HAb18G/CD147分子的转录后调控并不涉及后者mRNA水平的变化;miR-146a可通过调控HAb18G/CD147在细胞中的表达抑制肿瘤细胞MMPs的分泌和细胞的侵袭能力。提示miR-146a具有抑制肿瘤转移的治疗前景。