论文部分内容阅读
目的:本实验利用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)激活大鼠Tenon’s囊成纤维细胞中的核转录因子-κB(NF-κB),检测成纤维细胞的增殖情况与NF-κB、RNA结合蛋白Lin28B的表达变化,以研究NF-κB及Lin28B在成纤维细胞增殖中的作用机制。
方法:原代培养大鼠的Tenon’s囊成纤维细胞,利用免疫组化法进行鉴定。取传至第四代的细胞消化成为2×104/ml悬液种入96孔板,分别加入终浓度为10ng/ml、50ng/ml和100ng/ml的TNF-α溶液,并于作用3h、6h、12h、18h及24h后,借助CCK-8法检测鼠的Tenon’s囊成纤维细胞的生长状况。取传至第四代的细胞以2×104/ml消化悬液种入12孔板,随机分为三组:A组为正常对照组,加入不含药物的正常培养基,B组加入等量含TNF-α的终浓度为50ng/ml的培养基,C组在加入100μmol/L的PDTC干预细胞0.5h后加入等量TNF-α终浓度为50ng/ml的培养基,培养12h后检测细胞生长状况,并行免疫组化及Real-timePCR法检测各组NF-κBmRNA及Lin28BmRNA表达量的变化。
结果:
1.原代培养的大鼠Tenon’s囊成纤维细胞多呈长梭形,胞体周边可见细长状突起,细胞核为圆形,位于细胞中央。行免疫组化染色鉴定,示细胞波形蛋白抗体染色呈阳性,角蛋白染色呈阴性,证实所培养的细胞为成纤维细胞。
2.CCK-8法检测结果示,TNF-α激活NF-κB的最佳作用浓度为50ng/ml,最佳作用时间为12h。
3.三组成纤维细胞的OD值差异有统计学意义(F=97.216,P=0.000),B组细胞的OD值较A组明显增加(P=0.012),C组细胞的OD值较B组显著降低(P=0.017),但与A组相比较差异无统计学意义(P=0.175)。
4.三组成纤维细胞中的NF-κBmRNA表达差异有统计学意义(F=496.996,P=0.000),A组成纤维细胞的胞质中表达少量的NF-κB;而B组细胞中的NF-κB则大量表达于细胞核中,且NF-κBmRNA的表达量较A组明显提高(P=0.000);C组细胞的胞质与胞核中均表达少量NF-κB,而C组的NF-κBmRNA与B组相比表达量降低(P=0.000),与A组比差异无统计学意义(P=0.401)。
5.三组成纤维细胞的Lin28B主要在胞质中表达,且Lin28BmRNA表达量差异有显著统计学意义(F=552.956,P=0.000)。A组成纤维细胞表达极少量Lin28BmRNA;B组细胞中Lin28BmRNA的表达量则较A组有明显升高(P=0.000);C组细胞中的Lin28BmRNA表达量较B组明显降低(P=0.000),与A组相比则差异无统计学意义(P=0.661)。结论:
1.TNF-α可以激活Tenon’s囊成纤维细胞中的NF-κB,进一步激活Lin28B的转录和表达,导致了成纤维细胞的增殖;
2.PDTC可以阻断细胞中NF-κB的活化,进而下调Lin28B的表达,从而抑制Tenon’s囊成纤维细胞的增殖。
方法:原代培养大鼠的Tenon’s囊成纤维细胞,利用免疫组化法进行鉴定。取传至第四代的细胞消化成为2×104/ml悬液种入96孔板,分别加入终浓度为10ng/ml、50ng/ml和100ng/ml的TNF-α溶液,并于作用3h、6h、12h、18h及24h后,借助CCK-8法检测鼠的Tenon’s囊成纤维细胞的生长状况。取传至第四代的细胞以2×104/ml消化悬液种入12孔板,随机分为三组:A组为正常对照组,加入不含药物的正常培养基,B组加入等量含TNF-α的终浓度为50ng/ml的培养基,C组在加入100μmol/L的PDTC干预细胞0.5h后加入等量TNF-α终浓度为50ng/ml的培养基,培养12h后检测细胞生长状况,并行免疫组化及Real-timePCR法检测各组NF-κBmRNA及Lin28BmRNA表达量的变化。
结果:
1.原代培养的大鼠Tenon’s囊成纤维细胞多呈长梭形,胞体周边可见细长状突起,细胞核为圆形,位于细胞中央。行免疫组化染色鉴定,示细胞波形蛋白抗体染色呈阳性,角蛋白染色呈阴性,证实所培养的细胞为成纤维细胞。
2.CCK-8法检测结果示,TNF-α激活NF-κB的最佳作用浓度为50ng/ml,最佳作用时间为12h。
3.三组成纤维细胞的OD值差异有统计学意义(F=97.216,P=0.000),B组细胞的OD值较A组明显增加(P=0.012),C组细胞的OD值较B组显著降低(P=0.017),但与A组相比较差异无统计学意义(P=0.175)。
4.三组成纤维细胞中的NF-κBmRNA表达差异有统计学意义(F=496.996,P=0.000),A组成纤维细胞的胞质中表达少量的NF-κB;而B组细胞中的NF-κB则大量表达于细胞核中,且NF-κBmRNA的表达量较A组明显提高(P=0.000);C组细胞的胞质与胞核中均表达少量NF-κB,而C组的NF-κBmRNA与B组相比表达量降低(P=0.000),与A组比差异无统计学意义(P=0.401)。
5.三组成纤维细胞的Lin28B主要在胞质中表达,且Lin28BmRNA表达量差异有显著统计学意义(F=552.956,P=0.000)。A组成纤维细胞表达极少量Lin28BmRNA;B组细胞中Lin28BmRNA的表达量则较A组有明显升高(P=0.000);C组细胞中的Lin28BmRNA表达量较B组明显降低(P=0.000),与A组相比则差异无统计学意义(P=0.661)。结论:
1.TNF-α可以激活Tenon’s囊成纤维细胞中的NF-κB,进一步激活Lin28B的转录和表达,导致了成纤维细胞的增殖;
2.PDTC可以阻断细胞中NF-κB的活化,进而下调Lin28B的表达,从而抑制Tenon’s囊成纤维细胞的增殖。