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昆虫中肠是苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)发挥毒性作用的主要部位,Bt杀虫蛋白与昆虫中肠刷状缘膜囊泡brush border membrane vesicles(BBMV)上的受体蛋白结合是Bt作用机制中的关键步骤,因此中肠受体的改变被认为是昆虫对Bt毒蛋白产生抗性的主要机制。转Bt基因棉花在有效控制棉铃虫(Helicoverpa armigera)危害的同时也使棉铃虫对其产生抗性演化的风险,这将严重威胁到转Bt棉花的长期有效利用,因此了解Bt的抗性机制并制定相应的抗性治理政策对于延长Bt棉的使用寿命显得至关重要。为了探究棉铃虫的抗性机制,我们利用iTRAQ实验比较敏感与抗性棉铃虫品系中肠BBMV之间的差异表达蛋白,发现了很多Vacuolar H+-ATP酶基因蛋白表达量存在显著差异;而且已有研究报道V-ATP酶A亚基是一些昆虫Bt-Cry1Ac的结合蛋白,因此,本研究克隆了棉铃虫V-ATP酶A亚基基因,并对其在Cry1Ac发挥杀虫作用及抗性演化中的功能展开了初步研究。主要研究内容及结果如下:1、运用PCR结合RACE(rapid-amplification of cDNA ends)cDNA末端快速扩增技术,克隆了棉铃虫中肠V-ATP酶A亚基基因的cDNA序列全长。该cDNA序列全长2 578 bp(GenBank登录号:KP090287),开放阅读框1 863 bp,编码621个氨基酸。预测其分子量和等电点分别为68 KD和5.13,且N端没有信号肽,C端也没有潜在的GPI锚定位点,蛋白亲疏水性预测显示为亲水性,亚细胞定位结果主要位于细胞质,与V-ATP酶结构吻合。同源序列分析发现,棉铃虫与其他物种的V-ATP酶A亚基氨基酸序列同源性非常高,其相似性达90%以上,其中与鳞翅目烟草天蛾序列一致性最高,为95.48%。不同种属间的氨基酸序列差异主要在N端。说明V-ATP酶A亚基基因非常保守。2、利用实时荧光定量qRT-PCR对V-ATP酶A亚基的表达谱测定结果表明,棉铃虫不同发育历期V-ATP酶A亚基的表达量不同,主要在幼虫期表达,其中4龄表达量最高,其次是2龄,卵、蛹和成虫期的表达量较低。在肠道不同部位的表达量也有一定的差异,其中在中肠中表达量最高,其次是前肠,后肠的表达量显著地低于中肠和前肠的表达量。棉铃虫4龄幼虫取食含有Cry1Ac毒素蛋白的饲料后,中肠V-ATP酶A亚基表达量显著降低。3、将V-ATP酶A亚基全长进行原核表达,用western blot方法检测发现棉铃虫中肠BBMV上V-ATP酶A亚基有较高的表达量,但将表达的蛋白与Cry1Ac进行Ligand blot试验,发现原核表达的蛋白与Cry1Ac毒素不结合。4、比较棉铃虫敏感品系和抗性品系之间的核苷酸序列和氨基酸序列差异,发现抗性品系核苷酸序列有75个碱基发生突变,但氨基酸序列一致。Cry1Ac抗性棉铃虫中肠V-ATP酶A亚基在mRNA水平和蛋白水平上表达量都显著低于敏感品系棉铃虫的表达量。5、用RNAi方法将V-ATP酶A亚基基因沉默,检测V-ATP酶A亚基基因沉默对Cry1Ac毒力的影响,结果发现siRNA-A1基因沉默效果较好,在各个时间段的沉默效率为42%~55%。敏感品系棉铃虫注射siRNA-A1后,体重抑制率增加,除第3天60μg/mL浓度处理外,其他处理的体重抑制率均显著的大于对照。RNAi沉默基因表达,使敏感品系对Cry1Ac的敏感性增强。以上结果表明,V-ATP酶A亚基在棉铃虫中肠高表达,Cry1Ac处理敏感4龄幼虫后基因表达量降低,而且通过RNAi试验证实V-ATP酶A亚基基因沉默后使敏感品系棉铃虫对Cry1Ac的敏感性增强,但是棉铃虫对Cry1Ac产生抗性后,V-ATP酶A亚基基因和蛋白的表达量表现为下调,推测V-ATP酶A亚基在棉铃虫生长发育和能量代谢中起到重要作用,可能影响蛋白酶的合成和分泌,或影响Bt信号传导途径中ATP的水解、激活蛋白激酶A的过程,参与抵御Cry1Ac的毒杀作用,并在在棉铃虫Cry1Ac产生抗性的过程中起到一定的作用。明确的作用机制有待于进一步研究。