铜元素在多种生物化学途径中发挥着重要的作用,但当铜浓度过高时,就会产生毒性。近年来,由于工业、农业废水的排放以及采矿作业等多种人类活动,水体环境中铜的浓度升高,包括两栖动物在内的水生生物被慢性暴露于铜浓度较高的水体环境中。已有的研究表明,全世界范围内被污染的淡水铜浓度为50-560mg L^-1,该浓度远高于美国国家环境保护局制定的淡水铜浓度的标准(9-13μg L^-1)。中华大蟾蜍（Bufo gargarizans）是广泛分布于我国境内的两栖动物,也是最常见的无尾两栖类,其胚胎及蝌蚪发育过程全部在淡水中进行,因此,野生中华大蟾蜍蝌蚪更容易暴露于被铜污染的水体中。为了探讨不同浓度的Cu²⁺对中华大蟾蜍蝌蚪生长发育的影响,选择发育至26期的中华大蟾蜍蝌蚪共600只,平均分成5组,每组设4个平行组,分别暴露于Cu²⁺浓度分别为0、1、6.4、32和64μgL^-1的水体中,直至蝌蚪发育到变态完成期（46期）。在蝌蚪发育至42期时,称量蝌蚪的全长、后肢长、尾长、体重等参数；随机抽取各浓度组的5只蝌蚪,对其甲状腺进行组织学观察比较；随机抽取各浓度组3只蝌蚪提取总RNA,经过反转录、荧光实时定量PCR检测脱碘酶（Dio2,Dio3）和甲状腺激素受体（TRa, TRP） mRNA的表达,此外,再随机抽取各浓度组4只蝌蚪,分别提取后肢、尾、肝脏的RNA,经过反转录、荧光实时定量PCR分别检测Dio2, Dio3, TRα、TRβ、HSP, SOD 和 GLU mRNA的表达。在蝌蚪发育至46期时,称量已变态个体的全长和体重；随机抽取各浓度组3只蝌蚪,提取总RNA,检测Dio2, Dio3, TRα和TRβ mRNA的表达。在Cu²⁺暴露过程中,每天统计蝌蚪的死亡数和变态数。主要的结果与结论如下：1.长达63 d的慢性铜暴露实验影响了中华大蟾蜍蝌蚪的死亡率。实验所用最高浓度的Cu²⁺处理组(64μgL^-1)显著升高了中华大蟾蜍蝌蚪的死亡率（16.36%）（P≤0.01）,而暴露于1,6.4和32 μg L^-1处理组的蟾蜍蝌蚪的死亡率分别为4.72%,6.93%和8.43%,与对照组相比,均无显著差异。2.对暴露不同天数中华大蟾蜍蝌蚪的形态结果分析后显示,第16 d,暴露于6.4,32和64μgL^-1处理组的蟾蜍蝌蚪的全长显著减少了（P≤0.01）。另外,暴露于6.4,32和64μgL^-1处理组的蟾蜍蝌蚪的体重也显著降低了（P≤0.01）。而在暴露的第32 d,与对照组相比,暴露于6.4,32和64μg L^-1处理组的蟾蜍蝌蚪全长和体重均无显著差异。在暴露的第48 d,蟾蜍蝌蚪的全长和发育分期也均无显著差异。基于以上现象,我们推测第16d蟾蜍蝌蚪的生长所受的抑制反映的是蟾蜍蝌蚪在适应初期处于应激阶段,而第32 d和48 d已恢复到正常水平的生长参数代表一个相对快速的复原。3.慢性铜暴露实验影响了蟾蜍蝌蚪到达变态高峰期所需的时间以及尾吸收的时间。相对对照组来说,暴露于6.4,32和64μgL^-1处理组的蟾蜍蝌蚪到达42期的时间显著延长了（P<0.01）；暴露于6.4,32和64μg L^-1处理组的蟾蜍蝌蚪尾吸收的时间也显著延长了（P≤0.01）。以上结果表明慢性铜暴露迟滞了中华大蟾蜍蝌蚪的变态,而过长的幼体阶段通常会降低其适应能力。4.在变态高峰期（42期）,暴露于6.4,32和64μL^-1处理组的蟾蜍蝌蚪的全长显著减少了（P≤0.01）,体重显著降低了（P<0.01）,表明铜抑制了中华大蟾蜍蝌蚪的生长。5.暴露于64 μg L^-1处理组中的蟾蜍蝌蚪的后肢长和尾长均显著增加了（P<0.01）,我们推测是由延长的幼体阶段所导致。在46期,只有暴露于6.4 μg L^-1处理组中的蟾蜍蝌蚪的全长显著减少了（P<0.01）,其他处理组与对照组之间均无显著差异,因此我们推测慢性铜暴露对46期蟾蜍蝌蚪的生长没有明显的抑制作用。6.对不同浓度的Cu²⁺处理的蝌蚪甲状腺的组织学观察结果显示,在42期,对照组中甲状腺结构中滤泡是由一层紧密排列的滤泡上皮细胞包围,而64μg L^-1处理组中滤泡由多层排列不规则的滤泡上皮细胞包围,出现了甲状腺滤泡细胞增生的现象,说明高浓度的Cu²⁺改变了甲状腺的组织结构。7.荧光实时定量PCR法检测脱碘酶（Dio2和Dio3）在不同浓度的处理组的表达结果表明：在42期,Dio2 mRNA的表达不受影响,暴露于6.4,32和64μgL^-1处理组中蟾蜍蝌蚪Dio3 mRNA的表达显著上调了（P<0.05）。在46期,相对对照组来说,64μgL^-1处理组显著下调了Dio2 mRNA的表达（P≤0.01）,32和64μgL^-1的处理组显著上调了D io3 mRNA的表达（P<0.01）。下调的Dio2和上调的Dio3会导致靶组织的甲状腺激素（TH）水平的降低。8.荧光实时定量PCR法检测蝌蚪甲状腺激素受体TRa的表达结果后表明,在42期,32和64μg L^-1处理组显著下调了蟾蜍蝌蚪TRα mRNA的表达（P≤0.01）。TRa与蟾蜍蝌蚪的生长相关,下调的TRa抑制了蝌蚪的生长。9.荧光实时定量PCR法检测蝌蚪甲状腺激素受体TRβ的表达结果后表明,在42期和46期,32和64μg L^-1处理组均显著下调了蟾蜍蝌蚪TRβ mRNA的表达（P≤0.05）。TRβ主要与细胞凋亡相关,且随TH变化,因此我们推测TH的降低下调了TRβ,下调的TRβ迟滞了蝌蚪的变态。10.在实验最后一天（第63d）,对照组蟾蜍蝌蚪的平均变态率高达50%,而暴露于在6.4,32μL^-1和64μgL^-1处理组的蟾蜍蝌蚪平均变态率分别为39.30%,35.67%,28.77%。结果显示6.4,32μgL^-1和64 μgL^-1处理组显著降低了中华大蟾蜍蝌蚪的平均变态率（P<0.01）。11.荧光实时定量PCR法检测蝌蚪不同组织中热激蛋白（HSP）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GLU）的表达结果后表明,在42期,相对对照组,暴露于32μgL^-1和64μgL^-1的处理组中的蟾蜍蝌蚪后肢、尾、肝脏的HSP、 SOD mRN A的表达都显著下调了（P<0.01）。32和64μgL^-1的处理组也显著下调了蟾蜍蝌蚪后肢和尾GLU mRNA的表达（P<0.01）。以上结果表明高浓度的处理组能引起氧化损伤,破坏中华大蟾蜍蝌蚪的抗氧化系统。12.在检测的所有组织中,32和64μg L^-1的处理组显著下调了Dio2, TRa和TRβ mRNA的表达。在64μgL^-1的铜处理组中,蟾蜍蝌蚪后肢和肝脏Dio3 mRNA的表达显著下调了（P<0.01）。我们推测铜能够通过下调Dio2和Dio3引起TH水平的降低,从而下调TRa和TRβ。TH水平的降低能引起变态百分比的降低,并延长蟾蜍蝌蚪的变态时间。